Untersuchung von kupferhaltigen Aminoxidasen aus Pyrrolizidin-Alkaloid-produzierenden Pflanzen

Denker, Sabine Eleonore

Zu den Sekundärstoffwechselprodukten zählen die Pyrrolizidin-Alkaloide (PAs). Sie werden von einigen wenigen Pflanzen zur Verteidigung gegen Herbivoren konstitutiv gebildet. Es sind Esteralkaloide, die aus einer Necinbase und einer Necinsäure aufgebaut sind. Die Bildung der Necinbase in der PA-Biosynthese ist bis zur Homospermidinsynthase aufgeklärt worden. Diese verbindet den Primär- mit dem Sekundärstoffwechsel und bildet aus Putrescin und Spermidin Homospermidin (Hspd). Die weiteren Schritte bzw. Enzyme zur Bildung der Necinbase sind noch nicht aufgeklärt worden. Man nimmt an, dass es sich bei dem Hspd-umsetzenden Enzym um eine kupferhaltige Aminoxidase (CAO) handelt. Um das Hspd-umsetzende Enzym zu identifizieren, wurden die PA-Pflanzen Senecio vernalis und Eupatorium cannabinum mit verschiedenen Methoden untersucht. Es wurden drei CAO-homologe Sequenzen in S. vernalis und eine CAO-homologe Sequenz/ein CAO-homologes 3'Ende in E. cannabinum mit Hilfe der PCR-Techniken identifiziert. Nach Klonierung und heterologen Expression von zwei S. vernalis-Sequenzen in E. coli sind Inclusion bodies entstanden. Zur Gewinnung von aktivem Protein wurde die Expression in Pichia pastoris, die Co-Expression mit Chaperonen sowie die Solubilisierung und Rückfaltung der Inclusion bodies angewandt. Es wurde ein radioaktiver Aktivitätstest für CAOs etabliert. Dabei stellte sich ein großer Einfluss von Wasserstoffperoxid und Sauerstoff heraus. Über Signalpeptidanalyse wurden die drei S. vernalis-Sequenzen in den Peroxisomen in der Zelle lokalisiert. Mit der FPLC wurden Hspd-umsetzende Enzyme aus Wurzelrohextrakten angereinigt. Weitere Strategien wie Laser-Capture-Microscopy und differentielle PCR in Kombination mit Western-Blot-Analyse wurden angetestet.

Pyrrolizidine alkaloids (PAs) belong to the class of secondary compounds. There are constitutively produced in some special plants as a defence against herbivores. They are ester alkaloids which consist of a necine base and a necine acid. The formation of the necine base in the biosynthesis of PAs is investigated until the homospermidine synthase which connects the primary with the secondary metabolism. The homospermidine synthase catalyses the formation of homospermidine (hspd) out of putrescine and spermidine. The further steps and enzymes of the formation of the necine base are not identified. It is postulated that the enzyme that uses hspd as substrate should be a copper-containing amine oxidase (CAO). To find the enzyme that uses hspd as substrate the PA plants Senecio vernalis and Eupatorium cannabinum were analysed with several techniques. Three CAO homologues sequences of S. vernalis and one CAO homologue sequence/one CAO homologues 3'end of E. cannabinum were identified with PCR methods. Inclusion bodies were formed after cloning and heterologous expression of two S. vernalis sequences in E. coli. To get active proteins the expression in Pichia pastoris, the co expression with chaperones and the solubilisation and refolding of the inclusion bodies were tested. A radioactive assay for CAOs was established. A great influence of hydrogen peroxide and oxygen was turned out. The three S. vernalis sequences were located in the peroxisomes with signal peptide analysis. With FPLC technique the hspd using enzymes of root extracts were partly purified. Further methods like laser capture microscopy and differential PCR in combination with western blot were used.

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Denker, Sabine Eleonore: Untersuchung von kupferhaltigen Aminoxidasen aus Pyrrolizidin-Alkaloid-produzierenden Pflanzen. 2008.

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