Charakterisierung der durch Internalin A vermittelten Signaltransduktion in Epithelzellen

Fischer, Roman

Die vorliegenden Arbeit beschäftigt sich im Besonderen mit den zellulären Mechanismen, welche durch die Bindung des listeriellen Virulenzfaktors Internalin A an das Adhäsionsprotein E-cadherin in menschlichen Epithelzellen eingeleitet werden und zur Endozytose von E-cadherin und des Bakterium führen. Es konnte gezeigt werden, dass allein die Bindung von rekombinantem Internalin A an E-cadherin oder einen noch unbekannten alternativen Oberflächenrezeptor zu einer Phosphorylierung von Komponenten des E-cadherin Komplexes führt. Das Protein ß-catenin wird 5 Minuten nach Beginn der Stimulation von Epithel-Zellen mit Internalin A an Serin 45 phosphoryliert. Weiterhin konnte die Phosphorylierungsstelle, welche die Rekrutierung der Ubiquitin Ligase Hakai in den E-cadherin Komplex reguliert, durch massenspektrometrische Methoden identifiziert werden. Es konnte die Phosphorylierung von E-cadherin nach Internalin A Stimulation untersucht und bestätigt werden. Die Beteiligung und die Relevanz der E3-Ubiquitin-Ligase Hakai an der Endozytose von Listeria konnte in Infektionsexperimenten gezeigt werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Unterbrechung der Aktivität des Proteasoms durch die Behandlung von Zellen mit MG-132 ebenfalls zu einer signifikanten Reduktion der listeriellen Invasionseffizienz führt. Eine systematische Analyse von Internalin A induzierten Phosphorylierungsereignissen konnte eine Reihe weiterer Proteine ermitteln, welche auf der Wirtsseite für die Invasion von Listeria relevant sein könnten. Weiterhin wurde eine umfassende biochemische Charakterisierung der massenspektrometrischen Quantifizierung von Proteinen durch iTRAQ™, welche eine Intensitäts-abhängige Ermittlung von Regulationsfaktoren in iTRAQ™-markierten Proben durch die „Maximum Likelihood“-Methode ermöglichen.

The submitted thesis deals with the cellular mechanisms which are induced by the adhesion of the listerial virulence factor Internalin A to the adhesion protein E-cadherin and finally leads to the uptake of E-cadherin and the bacteria. The results show that the binding of recombinante Internalin A to E-cadherin or another still unknown receptor leads to the phosphorylation of components of the E-cadherin complex. The Protein ß-catenin gets phosphorylated at serine 45 5 minutes after the stimulation of epithelial cells with Internalin A. Furthermore the phosphorylation site which induces the recruitment of the E3 ubiquitin ligase Hakai to the E-cadherin complex could be identified by mass spectrometry. Results show that the phosphorylation of E-cadherin is induced by Internalin A stimulation. The relevance of Hakai for the endocytosis of Listeria could be highlighted by infections experiments. Furthermore the inhibition of the proteasome by MG-132 leads to a significant reduction of listerial infection efficiency. A systematic analysis of Internalin A induced phosphorylation events revealed proteins which may be relevant for the invasion of Listeria. Furthermore a comprehensive biochemical characterisation of the mass spectrometry based quantification of proteins leads to the intensity-dependent validation of regulation factors in iTRAQ™-labelled samples by the “Maximum Likelihood”-method.

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Fischer, Roman: Charakterisierung der durch Internalin A vermittelten Signaltransduktion in Epithelzellen. 2008.

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