Phosphoproteom-Analysen humaner Kinasen: Charakterisierung des c-Met-Signalweges nach Aktivierung durch InlB von Listeria monocytogenes

Reinl, Tobias

Das human-pathogene Bakterium Listeria monocytogenes induziert seine Phagozytose in eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen. Die Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinase c-Met durch den listeriellen Virulenzfaktor Internalin B (InlB) resultiert in einer Reißverschluss-artigen Aufnahme. Die Phosphorylierungs-abhängige Signalübertragung im c-Met-Signalnetzwerk wird durch Kinasen wie Src und Akt reguliert. Mit über 500 Mitgliedern zählen Proteinkinasen zu einer der größten Proteinfamilien im Menschen. Deren Aktivitätsstatus wird selbst über Phosphorylierungen an Serin-, Threonin- und Tyrosinseitenketten reguliert. Ein detailliertes Wissen über den Phosphorylierungs-Status InlB-beeinflusster Kinasen würde unser Verständnis über die zellulären Konsequenzen der listeriellen Wirt-Pathogen-Interaktion deutlich verbessern. Die vergleichende Analyse von Phosphorylierungs-Stellen an niedrig-exprimierten Proteinen wie Kinasen ist immer noch eine Herausforderung und benötigt neuartige Ansätze. Die vorliegende Studie demonstriert zum ersten Mal die erfolgreiche Kombination einer Kinase-spezifischen Affinitäts-Chromatographie mit einer IMAC-basierten Phosphopeptid-Anreicherung und der iTRAQ™-Quantifizierung für die Identifizierung InlB-beeinflusster Proteinkinasen im c-Met-Signalweg. Durch diese Strategie konnten 166 Phosphorylierungs-Stellen in 106 humanen Kinasen exakt bestimmt werden. Die vergleichende Quantifizierung jeder einzelnen Phosphorylierungs-Stelle führte zur Identifizierung von vier aus dem physiologischen HGF/SF-stimulierten c-Met-Signalweg bekannten Proteinkinasen. Darüber hinaus konnten neun Proteinkinasen analysiert werden, welche bislang nicht zum c-Met-Signalweg zugeordnet wurden. Die vorliegende Studie bietet somit eine innovative Kombination von Technologien an, welche neue Einblicke in die c-Met-Signalkaskade schafft und zukünftig die detaillierte Charakterisierung pathologisch relevanter Signalwege erleichtern wird.

The human pathogen Listeria monocytogenes exploits the c-Met signaling network to induce its phagocytosis into a broad range of host cells. Activation of c-Met is mediated by the listerial virulence factor Internalin B (InlB) and results in a zipper-like process of invasion. Phosphorylation dependend signal transduction downstream of c-Met is regulated by kinases like Src or Akt. Consisting of about 500 members, protein kinases belong to one of the largest protein families encoded by the human genome. Their activity states are mainly determined by specific phosphorylation on serine, threonine or tyrosine residues. A detailed knowledge about the phosphorylation state of InlB affected kinases subsequent to c-Met activation would significantly complement our existing knowledge of the cellular consequences induced by listerial host pathogen interaction. Comparative mapping of phosphorylation sites directly derived from low abundant signaling proteins such as kinases is still a challenge and requires sophisticated purification and quantitation technologies. This study demonstrates for the first time the successful combination of kinase-directed affinity chromatography with IMAC phosphopeptide purification and iTRAQ™ quantitation to investigate putative new kinases involved in InlB activated c-Met signaling cascade. With this strategy access to 166 phosphorylation sites derived from 106 human kinases was achieved. iTRAQTM quantitation of phosphorylation sites revealed InlB induced posttranslational modifications of kinases already known from HGF/SF studies. Moreover, nine additional kinases have been identified for the first time as InlB effector proteins. A comparable approach using the physiological ligand HGF/SF revealed common and different kinases downstream of c-Met. The present study offers an outstanding combination of technologies for the characterisation of pathological relevant signaling networks and provides new insides in the c-Met pathway.

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Reinl, Tobias: Phosphoproteom-Analysen humaner Kinasen: Charakterisierung des c-Met-Signalweges nach Aktivierung durch InlB von Listeria monocytogenes. 2008.

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