Synthese und NMR-spektroskopische Charakterisierung von Liganden für die CD4-induzierten Epitope im Hüllprotein gp120 von HIV-1

Klaukien, Volker Ralf

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Peptide synthetisiert, welche an die CD4-induzierten Epitope im Hüllprotein gp120 von HIV-1 binden. Die Peptidsequenzen wurden über phage-display screening ermittelt. Als Referenzpeptid wurde ein CCR5-Nt Peptid hergestellt, welches spezifisch an die CD4-i Epitope bindet. Da die Tyrosinreste im CCR5-Rezeptor als Tyrosin-O-Sulfat vorliegen, wurden die Peptide ebenfalls mit Tyrosin-O-Sulfat synthetisiert. Weiterhin wurde die Wechselwirkung der Peptide mit dem gp120/CD4 über NMR-spektroskopische Methoden charakterisiert. Hierfür wurden 15N markierte Aminosäuren in die Peptide eingebaut um die Änderungen der kreuz-korrelierten Relaxationsrate zwischen dem N-H Dipol und der chemischen Verschiebungsanisotropie des Stickstoffes bei Zugabe der Proteine zu messen. Über die Zunahme der kreuz-korrelierten Realaxtionsrate in der Mischung im Vergleich zum freien Peptid lässt sich direkt die Dissoziationskonstante des Komplexes abschätzen. Die aus dem phage-display screening erhaltene XD3 Sequenz zeigte eine Affinität im mikromolaren Bereich, allerdings nicht in Abhängigkeit von sCD4. Das CCR5-Nt Peptid zeigte in den Messungen nur eine schwache Bindung im hohen mikromolaren Bereich. Da mit nur einer markierten Aminosäure die Wechselwirkung unzureichend charakterisiert werden kann, wurde ein CCR5-Nt Peptid synthetisiert, in welchem ein Großteil der Sequenz 15N markiert vorliegt. Um die Stabilitätsprobleme mit dem Tyrosin-O-Sulfat zu umgehen, wurde ein Mimetikum synthetisiert, welches vollkommen stabil unter sauren Abspaltungsbedingungen ist. Die weitergehenden Untersuchungen mit dem mehrfach 15N-markierten, modifizierten CCR5-Nt Peptid bestätigten, dass nur eine schwache Wechselwirkung im millimolaren Bereich vorliegt, die nicht CD4 abhängig ist.

In the present work peptides were synthesized that bind to the CD4-i epitopes in the glycoprotein gp120 of HIV-1. Initially, we synthesized a peptide derived from the screening results of a phage displayed peptide library. In addition, a CCR5 Nt peptide, known to bind gp120 in a CD4 dependent manner was synthesized as reference peptide. Since the tyrosine O-sulfation of the CCR5 receptor is essential for its ability to serve as a coreceptor, we also included tyorine O-sulfate in our peptides. The peptide/protein complexes were studied with NMR spectroscopy. We synthesized the peptides with 15N labelled residues and measured the change in the cross correlated relaxation rate between the N-H dipole and the 15N chemical shift anisotropy of the free peptide compared to the peptide/protein complex. The increase of the cross correlated relaxation rate allows an estimation of the dissociation constant of the complex. The sequence from the phage display screening shows a low affinity in the micro molar range that is not dependent on CD4. The CCR5 Nt peptide showed a weak binding in the high micro molar range. In order to study the binding more thoroughly we synthesized a CCR5 Nt peptide with several 15N labelled residues. The tyrosine-O-sulfate was substituted with a tyrosine O-sulfate analogue that is more stable and mimics the sulfated residue. The additional NMR experiments with this peptide confirmed the low affinity of the peptide that was not dependent on CD4.

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Klaukien, Volker Ralf: Synthese und NMR-spektroskopische Charakterisierung von Liganden für die CD4-induzierten Epitope im Hüllprotein gp120 von HIV-1. 2007.

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