Die Glutamyl-tRNA Reduktase aus Escherichia coli - Substraterkennung und Interaktion mit der Glutamat-1-semialdehyd-2,1-Aminomutase

Lüer, Corinna

Die Tetrapyrrolbiosynthese in Pflanzen, Archaea und den meisten Bakterien beginnt mit der NADPH-abhängigen Reduktion von tRNA-gebundenem Glutamat zu Glutamat-1-semialdehyd (GSA), katalysiert durch die Glutamyl-tRNA Reduktase (GluTR). Dieser hochreaktive Aldehyd wird im folgenden Schritt von der Glutamat-1-semialdehyd-2,1-Aminomutase (GSA-AM) zu 5-Aminolävulinsäure (ALA) umgewandelt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Wechselwirkung zwischen der Escherichia coli GluTR und der GSA-AM mittels Co-Immunopräzipitation und Gelfiltrationsanalysen nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass zur Komplexbildung weder Substrate noch beteiligte Cofaktoren benötigt werden. Eine wesentliche Funktion des GluTR/GSA-AM Komplexes ist die Vermeidung von unerwünschten Nebenreaktionen des reaktiven GSA mit dem Lösungsmittel durch das „metabolic channeling“, wodurch eine effiziente ALA-Bildung gewährleistet wird. Im zweiten Teil der Arbeit konnte durch Mutagenesestudien sechs konservierter Aminosäurereste des aktiven Zentrums der E. coli GluTR ein genaues Bild der Erkennung des Glutamat-Teils des Substrats im aktiven Zentrum erstellt werden. Mit Hilfe der misacylierten [14C]Gln-tRNA(Glu) wurde gezeigt, dass die Erkennung des Glutamats durch Arginin 52 und dem umgebenden Wasserstoffbrückennetzwerk nicht essentiell für die GluTR-Erkennung ist. Eine strukturelle Flexibilität der Region um Arginin 52 wurde abgeleitet. Diese eher unerwarteten Ergebnisse deuten wiederum auf eine Funktion der Aminosäurereste dieses Teils des aktiven Zentrums beim „metabolic channeling“ hin. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Glutamin 116 eine wichtige Funktion bei der Positionierung des NADPH Cofaktors für einen möglichst effektiven Hydridtransfer besitzt. Über das molekulare Verständnis der Funktion der Aminosäurereste im aktiven Zentrum der E. coli GluTR wurden neue Ansatzpunkte zur Identifizierung von neuen Inhibitoren und damit zur Entwicklung neuer Antibiotika und Herbizide geschaffen.

The biosynthesis of tetrapyrroles in plants, archaea and most bacteria starts with the NADPH-dependent reduction of tRNA-bound glutamate to glutamate-1-semialdehyde (GSA), catalyzed by glutamyl-tRNA reductase (GluTR). During the following step this highly reactive aldehyde is transformed into 5-aminolevulinic acid (ALA) by glutamate-1-semialdehyde-2,1-aminomutase (GSA-AM). Within the scope of this work the interaction between the Escherichia coli GluTR and GSA-AM was shown via co-immunoprecipitation and gel permeation chromatography analysis. Complex formation was found independent of substrate and cofactors. An essential function of the GluTR/GSA-AM complex is the prevention of undesirable side reactions of the reactive GSA with the solvent via metabolic channeling, by which an efficient ALA-formation is guaranteed. During the second part of this thesis a detailed picture of recognition of the glutamate part of the substrate in the active site was achieved through mutagenesis studies of six conserved amino acid residues in the active site. Using misacylated [14C]Gln-tRNA(Glu) it was shown that glutamate recognition through arginine 52 and the surrounding hydrogen bonding network is not essential for GluTR-recognition. A structural malleability of the region around arginine 52 was deduced. These rather unexpected results indicate towards a function of the amino acid residues from this part of the active site during the metabolic channeling. Furthermore it was shown, that glutamine 116 may be crucial in the positioning of the NADPH cofactor to allow for productive hydride transfer. About the distinct function of the active site residues of the E. coli GluTR new information was provided and so new starting points to identify new inhibitors and for the development of new antibiotics and herbicides were created.

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Lüer, Corinna: Die Glutamyl-tRNA Reduktase aus Escherichia coli - Substraterkennung und Interaktion mit der Glutamat-1-semialdehyd-2,1-Aminomutase. 2007.

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