Optimierung der Kultivierung humaner hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen und deren Expansion in einem miniaturisierten Bioreaktorsystem

Griesel, Carsten

Das primäre Interesse dieser Arbeit galt der Expansion von adulten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen aus peripherem Blut. Es konnte ein Basalmedium identifiziert werden, welches die Expansion optimal unterstützt. Mit L-Serin und L-Asparaginsäure konnten zwei limitierende Aminosäuren dieses Mediums identifiziert werden, durch Supplementierung die Formulierung verbessert und die Expansionsleistung weiter gesteigert werden. SCF und Interleukin-3 wurden selbstständig auf der Basis des Baculovirus-Expressionssystems in Insektenzellen hochaktiv exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die Notwendigkeit einer permanenten Stimulation mit Wachstumsfaktoren konnte eindeutig nachgewiesen werden. Zur Abschätzung des Potentials von Zell-Zell-kontaktfreien Kokultivierungsstrategien als Alternative zum Einsatz von rekombinanten Wachstumsfaktoren wurden konditionierte Zellkulturüberstände verschiedener primärer Zelltypen sowie und kontinuierlicher Zelllinien untersucht. Eine Stimulation konnte für humane Knochenmarkfibroblasten und HUVEC eindeutig gezeigt werden. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Weiterentwicklung und dem Einsatz eines neuartigen gemeinsam einem industriellen Partner realisierten miniaturisierten, voll-kontrollierten Bioreaktorsystems zur submersen Kultivierung von humanen peripheren Stamm- und Vorläuferzellen. Zunächst wurde das System verfahrenstechnisch hinsichtlich der Mischzeit und des kLa-Wertes charakterisiert. Über initiale Kultivierungen wurde der Drehzahlbereich optimiert und auftretende Scherkräfte als kritisch eingestuft. Zur Reduzierung der auftretenden Scherkräfte, wurde der scherprotektive Zellkulturzusatz Pluronic F-68 erfolgreich eingesetzt. Die kontinuierliche Medienperfusion war geeignet die Expansionsleistung des Bioreaktors weiter zu steigern.

The primary goal of the thesis was the expansion of human hematopoietic stem and precursor cell isolated of peripheral blood. A basic culture medium was identified which supports optimally the expansion of stem and precursor cells. L-aspartic acid and L-serin were identified as limiting amino acids in the media formulation. Supplementation with higher concentrations of these amino acids was suitable to improve the formulation of the medium and the expansion results. Stem cell factor (SCF) and interleukin-3 were generated on the basis of the baculo-virus expression system with a high specific biological activity and characterized in detail. The necessity of a permanent stimulation and there fore presence of growth factors was clearly demonstrated. The potential to stimulate the expansion of stem and precursor cells was clearly shown for conditioned media generated by human umbilical vein endothelial cells and bone marrow fibroblast. Special emphasis was laid on the development, technical realization and characterization of a new miniaturized and fully controlled continuously stirred bioreactor system for suspension culture. The stirrer speed was considered to be a critical factor for the outcome of the culture. Pluronic F-68 was successfully used to reduce the created hydrodynamic shear stress and improve expansion results. The implementation of a continuous media perfusion was suitable to improve the culture results significantly.

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Griesel, Carsten: Optimierung der Kultivierung humaner hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen und deren Expansion in einem miniaturisierten Bioreaktorsystem. 2008.

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