Biochemische und funktionelle Charakterisierung der C-terminalen Domänen der Molybdäncofaktor-Sulfurasen ABA3 und HMCS aus Arabidopsis thaliana und Homo sapiens

Wollers, Silke

Die C-terminalen Domänen der Molybdäncofaktor (Moco)-Sulfurasen ABA3 (ABA3-CT) und HMCS (HMCS-CT) aus A. thaliana und H. sapiens wurden in dieser Arbeit erstmalig funktionell und biochemisch analysiert. An beiden Domänen konnte das spezifische Binden von Moco nachgewiesen werden, wovon zwei Drittel in der von den Zielproteinen Aldehydoxidase und Xanthindehydrogenase benötigten sulfurierten Form vorliegen. In Co-Inkubationsversuchen mit freiem Moco und ABA3-CT konnte ein KD-Wert von 550 nM bestimmt werden, der eine hoch affine Bindung von Moco an ABA3-CT demonstrierte. Rekombinant exprimierte ABA3-CT- und HMCS-CT-Varianten, die in Pflanzen-Mutanten bzw. in Xanthinurie Typ II-Patienten auftretende Mutationen widerspiegelten, zeigten starke Reduktion bzw. den kompletten Verlust des sulfurierten Moco, der somit essentiell für die Funktion der Moco-Sulfurase ist. Basierend hierauf wurde ein Moco-Bindemotiv in ABA3-CT und HMCS-CT identifiziert. Die Co-Inkubation der Zielproteine mit ABA3-CT, beladen mit sulfuriertem Moco, führte zu Überaktivierung derselben, was die Relevanz des ABA3-CT für ihre Aktivierung untermauerte. Mutationen von strikt konservierten Cysteinen zeigten einen Einfluss des Cysteins 758 in ABA3-CT auf den Sulfurierungsstatus des gebundenen Moco. Da ein Persulfid-Transfer von ABA3-NifS zu ABA3-CT in vitro gezeigt werden konnte, ist anzunehmen, dass dieser Persulfid-Schwefel die Quelle des Schwefels am Moco von ABA3-CT ist. Als ein zu den C-Termini der Moco-Sulfurasen homologes Protein wurde das „mitochondrial amidoxime reducing component“-Protein mARC aus Schweinelebermitochondrien identifiziert. mARC reduziert im Komplex mit Cytochrom b5 und Cytochrom b5-Reduktase NADH-abhängig Amidoxime zu den korrespondierenden Amidinen und stellt möglicherweise ein Detoxifizierungssystem für natürliche Mutagene dar. Da die Aktivität von mARC strikt Moco-abhängig ist, konnte mARC als ein neues eukaryotisches Molybdoenzym klassifiziert werden.

The C-terminal domains of the molybdenum cofactor (Moco) sulfurases ABA3 (ABA3-CT) and HMCS (HMCS-CT) from A. thaliana and H. sapiens were biochemically and functionally analyzed in this work. For both domains the specific binding of Moco could be determined, whereof two-thirds were in the sulfurated form required by the target-proteins aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase. By coincubation-experiments of free Moco and ABA3-CT a KD-value of 550 nM could be identified which demonstrated a high affinity binding of the Moco to ABA3-CT. Recombinantly expressed ABA3-CT- and HMCS-CT-variants representing mutations that occur in A. thaliana-mutants and in patients with xanthinuria type II showed strong reduction or complete loss of the sulfurated Moco which therefore is essential for the functioning of Moco-sulfurase. Based on these results a Moco-binding-motive could be identified. Co-incubation of the target-proteins with ABA3-CT, loaded with sulfurated Moco, led to super-activation of these, which underpinned the relevance of ABA3-CT for their activation. Mutations of strictly conserved cysteine-residues showed the influence of cysteine 758 in ABA3-CT on the sulfuration-state of the bound Moco. As a persulfide-transfer from ABA3-NifS to ABA3-CT could be shown in vitro, it can be assumed that this persulfide-sulfur is the source of the sulfur bound to Moco of ABA3-CT. The “mitochondrial amidoxime reducing component”-protein mARC from pig-liver mitochondria was identified as a homologue to Moco-sulfurase C-terminal domains. mARC reduces, along with cytochrome b5 and cytochrome b5 reductase, amidoximes to their corresponding amidines in a NADH-dependent way which possibly is a detoxification system for naturally occurring mutagens. As the activity of mARC is strictly depending on Moco-binding, mARC could be classified as a new eukaryotic molybdoenzyme.

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Wollers, Silke: Biochemische und funktionelle Charakterisierung der C-terminalen Domänen der Molybdäncofaktor-Sulfurasen ABA3 und HMCS aus Arabidopsis thaliana und Homo sapiens. 2008.

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