Charakterisierung der Ligandenbindungs-Funktion für das Tumorsuppressorprotein Profilin I

Rosan, Stefania

Profilin I (PFNI) ist ein 12 bis 16 kDa großes, ubiquitär exprimiertes, essentielles Protein. Aufgrund seiner Interaktion mit Aktin besitzt Profilin eine polymerisationsfördernde Funktion und wirkt damit regulierend auf die Aktindynamik der Zellen. Durch die Interaktion mit PIP2 ist Profilin auch direkt in Signaltransduktionswege eingebunden. Ferner wirkt Profilin I als Tumorsuppressor in Brustkrebszellen, welche durch einen reduzierten Profilingehalt charakterisiert sind. Die Restauration des Profilinspiegels in der Brustkrebszelllinie CAL51 führt zur Suppression der Tumorigenizität, wobei eine intakte Aktin-Bindungsregion essentiell für diese Funktion ist. In Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Profilin I und seinen Liganden durch die Generierung von stabilen Zellklonen, die Wildtyp-Profilin, eine Aktin- (PFNI/AD) bzw. eine PIP2-Bindungsmutante des Profilin I (PFNI/LD) exprimierten, untersucht. Die mRNA dieser rekombinanten Profiline waren resistent gegenüber der RNAi-Behandlung. In diesem zellulären System war es möglich, die Expression des endogenen Profilin I durch RNAi-Behandlung auszuschalten, wobei der rekombinante Profilingehalt nicht reduziert wurde. Die RNAi-Versuche zeigten, dass sowohl das Wildtyp- als auch das Profilin mit einer reduzierten PIP2-Bindung den Verlust des endogenen Proteins kompensieren konnten, wobei die Zellen, die PFNI/AD exprimierten, eine höhere Apoptoserate aufwiesen. Immunfluoreszenzstudien zeigten, dass die Zellen, die PFNI/LD exprimieren, weniger und diffusere Stressfasern, aber ausgeprägtere Adhäsionsgürtel besaßen. Außerdem wurde bei diesen Zellen eine verminderte Fähigkeit zur Koloniebildung in Weichagar beobachtet. Weitere Untersuchungen zeigten eine gesteigerte Adhäsions- und Ausbreitungsrate der Zellen sowie eine erhöhte Migrationsrate. Die PIP2-Bindung erweist sich somit als wichtiger Faktor in der Regulation der Aktivität von Profilin auf das Aktin-Cytoskelett.

Profilin 1 (PFN1) is a 12 to 16 kDa small ubiquitous essential protein. As actin-binding protein profilin 1 promotes actin polymerisation and regulates the actin dynamic in cells. Profilin is also involved in signal transduction pathways through its ability to bind PIP2. Further, profilin 1 has been shown to act as tumor suppressor in breast cancer cells, which express low levels of the protein. The increase of profilin level in the breast cancer cell line CAL51 suppresses the tumorigenicity, whereas a functional actin binding site is necessary for this activity. To analyze the influence of the interaction between profilin 1 and its ligands stable CAL51 clones that express PFN1 wild type and two PFN1 mutants, defective either in binding to actin (PFN1/AD) or to PIP2 (PFN1/LD) were generated. The mRNAs of these proteins were resistant to RNAi treatment. In this cellular system it was possible to knock down the endogenous PFN1 by RNAi, while the expression level of recombinant profilin was not decreased. The experiments with RNAi have shown that exogenous wild type as well as the PIP2 binding deficient profilin compensates the knockdown of endogenous PFN1. However cells expressing PFN1/AD displayed a marked increase of apoptosis. The fluorescence analysis revealed that stress fibers in PFN1/LD expressing cells were not well organized, while the peripheral belts were thicker formed. Furthermore, these cells displayed a reduced ability to grow in soft agar, whereas other experiments indicated an increase in adhesion, spreading and migration rate. Hence the interaction between profilin und PIP2 plays a decisive role for the regulation of the actin cytoskeleton.

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Rosan, Stefania: Charakterisierung der Ligandenbindungs-Funktion für das Tumorsuppressorprotein Profilin I. 2007.

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