Produktion einer polyesterspaltenden Hydrolase in E. coli und vergleichende Untersuchungen zum Abbaumechanismus an Polyestern

Dresler, Karolin

Die polyesterspaltende Hydrolase (rTfH) aus Thermobifida fusca fusioniert mit einer OmpA-Signalsequenz und einem His6-Tag wurde in Escherichia coli heterolog produziert. Die rTfH-Produktion in Batch- und Hochzelldichtekultivierungen (HDF) erzielte im Vergleich zum Wildstamm T. fusca um mehr als das 100fache höhere Produktivitäten. In den Batchkultivierungen wurde rTfH in den periplasmatischen Raum transportiert, von wo aus rTfH unerwartet ins Kulturmedium segregierte. In der HDF verblieb rTfH größtenteils im Periplasma und gelöst im Cytoplasma. Erste Untersuchungen zeigen, dass die rTfH-Translokation wachstumsgekoppelt zu sein scheint. Für die auch PET hydrolysierende rTfH wurde zum einen ein kostengünstiges Verfahren entworfen, das in einem stabilen rTfH-Rohextrakt mit einem rTfH-Gehalt von etwa 5 % (w/w) resultierte. Ein weiteres zweistufiges Aufreinigungsverfahren lieferte eine hochreine Hydrolase mit einer spezifischen Aktivität von 445 UpNPP mL-1. rTfH wurde in vergleichenden Untersuchungen mit der Lipase PsL aus Pseudomonas spec. und der dP(3HB)-Depolymerase PhaZ5 aus Paucimonas lemoignei betrachtet. Der Abbau der festen Polymere mit PsL und rTfH gehorchte dem Prinzip der Kettenmobilität. Die Annäherung der Messtemperatur an den Polyesterschmelzpunkt auf weniger als 30 °C führte zu einer deutlichen Erhöhung der Abbaugeschwindigkeit. Bei der PhaZ5 hingegen, hochspezifisch gegenüber hochschmelzendem dP(3HB), dass in kristalliner Form von rTfH und PsL nicht angegriffen wird, fand dieses Prinzip vordergründig keine Anwendung. Die hohen Abbauraten gegenüber dP(3HB) lassen sich offenbar auf eine substratspezifische Adsorption zurückführen, die offenbar eine lokale Erhöhung der Kettenmobilität zur Folge hat. Im Gegensatz zu PsL und PhaZ5 hydrolysierte die nicht grenzflächenaktivierte rTfH die Polyester bis zur Stufe der monomeren Polymerbestandteile . Die Generierung eines TfH-Proteinmodells zeigte, dass keine "Deckel"-Domäne das aktive Zentrum bedeckt.

The hydrolase (Thermobifida fusca hydrolase, TfH) from T.fusca was produced in Escherichia coli as fusion protein using an OmpA leader sequence and a His6 tag. Productivity could be raised more than 100-fold. Both batch and fed-batch cultivations yielded comparable cell specific productivities whereas volumetric productivities differ largely. In batch cultivations the generated rTfH was translocated to the periplasm wherefrom it was completely released into the extracellular medium. In fed-batch runs most of the produced rTfH remained as soluble protein in the cytoplasm and only a fraction of about 35 % was translocated to the periplasm. Migration of periplasmic proteins in the medium was obviously coupled with growth rate and this final transport step apparently played an important role in product localization and efficacy of the Sec pathway. Two purification routes were performed which resulted either in a rTfH crude extract with 5 % rTfH (w/w), or in a highly purified hydrolase with an activity of 445 UpNPP mL-1. rTfH was compared with the lipase PsL from Pseudomonas spec. and the dP(3HB)-depolymerase from Paucimonas lemoignei. The degradation of synthetic polymers with PsL and rTfH followed the concept of chain mobility. A temperature difference between the polyester melting point and the degradation temperature of less than 30 °C lead to a significant increase of the degradation rate. However, for PhaZ5, which is specific for the high melting polyester dP(3HB), the concept of chain mobility was apparently not applicable. The high degration rates, observed during the dP(3HB) degration can apparently be attributed to a substrate specific adsorption, which lead to a local increase of the chain mobility on the polymer surface. Compared to PsL and PhaZ5 the not interfacial activated rTfH degraded polymers to its monomeric compounds. The generation of a TfH protein model did not show a lid domain on the active site.

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Dresler, Karolin: Produktion einer polyesterspaltenden Hydrolase in E. coli und vergleichende Untersuchungen zum Abbaumechanismus an Polyestern. 2007.

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