Rational Pathogen Design: Extending the Host Range of Listeria monocytogenes by Thermodynamically Re-engineering the Internalin / E-Cadherin Interface

Wollert, Thomas

Krankheitserreger besitzen eine charakteristische Ausstattung mit Virulenzfaktoren, die spezifisch mit einzelnen Wirtsmolekülen interagieren. Diese Spezialisierung führt jedoch dazu, dass nicht alle Spezies infiziert werden. Neue Krankheiten werden vorwiegend von bereits existierenden Erregern ausgelöst, die durch Mutationen in ihren Virulenzfaktoren zuvor unzugängliche Spezies infizieren können. Der mit der Nahrung aufgenommen Krankheitserreger Listeria monocytogenes exprimiert das Invasionsprotein Internalin (InlA), das die Aufnahme der Bakterie in Wirtszellen vermittelt. Die Bindungsspezifität dieses Moleküls limitiert jedoch die für L. monocytogenes zugänglichen Spezies. Es kann den Menschen, nicht jedoch die Maus infizieren. Durch rationales Design wurde InlA so verändert, dass es den humanen Rezeptor E-Cadherin (hEC1) mit höherer Affinität erkennt was gleichzeitig die Erkennung von E-Cadherin der Maus (mEC1) ermöglicht. Auf atomarer Ebene wurden Regionen mit geringer Komplementarität in der Interaktionsfläche von InlA und hEC1 identifiziert, indem die Kristallstruktur des Erkennungskomplexes analysiert wurde. Einzelne Aminosäure-Substitutionen, die die Bindungsaffinität zu hEC1 erhöhen sollten, wurden in InlA eingeführt. Strukturelle Änderungen wurden kristallographisch verifiziert. Die Bindungsaffinität sowie Bindungsenthalpie und –entropy wurden mittels Isothermer Titrationskalorimetrie bestimmt. Alle vier Substitutionen verstärkten die Affinität von InlA zu hEC1 beträchtlich. Die Korrelation von Struktur und Biophysik führte zu einem besseren Verständnis des Beitrages einzelner Atome zur Bindungsenergie. Die Kombination von nur zwei Substitutionen erhöhte die Affinität von InlA dramatisch. Des weiteren erkennt das optimierte InlA mEC1 mit einer Affinität, die der InlA / hEC1 Interaktion gleicht. Veränderter Bakterien, die beide Mutationen tragen, können Mäuse effizient befallen, was ein vielseitiges Modell zur Erforschung der humanen Listeriose darstellt.

Pathogens have evolved a dedicated set of virulence factors that specifically interact with individual host molecules. This specialization limits pathogens to a defined range of hosts. Newly emerging diseases overwhelmingly involve existing pathogens whose virulence factors have been mutated to allow them to infect previously inaccessible hosts. The human food borne pathogen Listeria monocytogenes expresses the invasion protein internalin (InlA) that enable bacterial uptake into host cells. This molecule restricts L. monocytogenes to a defined range of hosts including humans but prevents infections of mice. In emulating spontaneous changes of host specificity, InlA has been rationally re-engineered to increase the affinity for human E-cadherin (hEC1), thereby extending the specificity to allow recognition of murine E-cadherin (mEC1). At the atomic level, regions of low complementarity in the interaction interface of InlA and hEC1 were identified by analyzing the crystal structure of the recognition complex. Single amino acid substitutions in InlA that would potentially increase its weak binding affinity for hEC1 were introduced into InlA. Structural changes were verified crystallographically. Binding affinities as well as binding enthalpy and entropy were determined by isothermal titration calorimetry. All four rationally chosen, single substitutions increase binding affinity strongly. The correlation of structural data with thermodynamic characteristics provides unique insights into atomic contributions to binding enthalpy and entropy. Combining a mere two single substitutions transforms the weak interaction of wild-type proteins into a tight recognition. Biophysically, re-engineered InlA recognizes mEC1 with an affinity similar to that of the wild-type InlA / hEC1 interaction. Incorporating these two mutations into the listerial genome extends the host range of L. monocytogenes to include the mouse, thereby creating a versatile murine model of human listeriosis.

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Wollert, Thomas: Rational Pathogen Design: Extending the Host Range of Listeria monocytogenes by Thermodynamically Re-engineering the Internalin / E-Cadherin Interface. 2007.

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