Novel Salmonella vectors with in vivo amplifiable plasmids for vaccination and tumor therapy

Endmann, Anne

Lebende attenuierte Salmonellen sind vielversprechende Überträger von Proteinen und DNA für die Vakzinierung und Tumortherapie. Konventionelle Expressionssysteme basieren auf Multicopy Plasmiden, die eine starke metabolische Belastung für die Transformanten darstellen und deren Effizienz verringern. In dieser Arbeit wurde ein in vivo induzierbares Plasmidamplifikationssystem in Salmonella enterica serovar Typhimurium SL7207 etabliert. Die amplifizierbaren Plasmide enthalten zwei Replikationsursprünge. Das erste Replikon stellt eine minimale Kopiezahl der Plasmide unter uninduzierten Bedingungen sicher. Ein zweites Mediumcopy Replikon wurde durch die Salmonellen-spezifischen in vivo induzierbaren Promotoren PsifA, Pstm1630 und PphoN oder den PBAD Promotor kontrolliert. Durch den PsifA Promotor konnte eine Amplifikation der Plasmidkopiezahl von 1-5 auf 50-100 und eine starke Expression von plasmidkodierten Antigen im Induktionsmedium und nach einer Infektion von Makrophagen und Mäusen induziert werden. Der PsifA Promotor wird allerdings schon im Darm von Mäusen aktiviert, was die Invasionseffizienz von oral verabreichten Stämmen herabsetzt. Nach intravenöser Gabe konnten substantielle Ovalbumin-spezifische CD4+ T Zell Antworten gemessen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Plasmidamplifikation durch den L-Arabinose induzierbaren PBAD Promotor aktiviert. Die Fernsteuerung des Systems wurde in Kultur, in infizierten Makrophagen sowie in Tumor, Milz und Leber von tumortragenden Mäusen demonstriert. Dabei führte die Gabe des Zuckers zu einer starken Reporteraktivität, insbesondere bei simultaner Kontrolle von Plasmidampifikation und Reporterexpression durch PBAD. Außerdem war eine wiederholte Induktion der Reporterexpression in vivo möglich. Zusammenfassend sollte das in vivo induzierbare Plasmidamplifikationssystem zu einer Optimierung der Salmonellen-vermittelten Übertragung von prophylaktischen und therapeutischen Molekülen führen.

Live attenuated Salmonella are highly potential vectors for the delivery of proteins and DNA with applications in vaccination and tumor therapy. Conventional expression systems are based on maintenance of the plasmid at multi-copy numbers representing a high metabolic burden for the bacteria that results in a decreased performance of the vector. In this work, a system for in vivo inducible amplification of expression plasmids was established in Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL7207. Amplifiable plasmids contain two replication origins. The first replicon ensures the minimal-copy number state under non-inducing conditions. A second medium-copy replicon was placed under control of Salmonella-specific in vivo inducible promoters PsifA, Pstm1630 and PphoN or the PBAD promoter. PsifA exhibited strong amplification of the plasmid copy number from 1-5 to 50-100 copies and enhanced expression of plasmid-encoded antigen in induction medium, upon infection of macrophages and mice. However, in vivo imaging demonstrated that PsifA is activated already early in the mouse intestine resulting in impaired invasion efficiency of orally administered plasmid amplifying strains. Nevertheless, after intravenous immunization, plasmid amplification resulted in substantial ovalbumin-specific CD4+ T cell responses. In the second part of this work, plasmid amplification could be activated by the L-arabinose inducible PBAD promoter. This remote control was possible in culture, upon infection of macrophages and in tumor, spleen and liver of tumor-bearing mice. Administration of the sugar resulted in high reporter activity especially when plasmid amplification and reporter expression were simultaneously driven by PBAD. In addition, repeated induction of reporter expression could be demonstrated in vivo. In summary, inducible plasmid amplification should contribute to the optimization of Salmonella-mediated delivery of prophylactic and therapeutic molecules.

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Endmann, Anne: Novel Salmonella vectors with in vivo amplifiable plasmids for vaccination and tumor therapy. 2007.

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