Dynamische Aspekte der Kernarchitektur: S/MARs und ihre Rolle bei der Etablierung aktiver Transkriptionseinheiten

Winkelmann, Silke GND

Das Genom eukaryotischer Organismen unterliegt einer strikten Organisation, die eine effektive Regulation zellspezifischer Genexpression ermöglicht. S/MAR-Elemente sind die strukturellen Komponenten der DNA, die das Genom in unabhängig regulierbare Domänen gliedern und sowohl geregelte Replikation als auch gewebespezifische Expression ermöglichen. S/MARs erzielen diese Funktion offenbar durch Anheftung der DNA an die Kernmatrix - eine Funktion, die durch spezifische Struktureigenschaften determiniert wird. Hierbei kommt ihrer hohen Tendenz zur Ausbildung einzelsträngiger Bereiche besondere Bedeutung zu. Diese Eigenschaft liegt dem SIDD-Profil zur Vorhersage von S/MARs aus Sequenzdaten zugrunde. In der vorliegenden Arbeit standen Analysen zur Chromatinstruktur von S/MAR-Elementen im Mittelpunkt. Im Zuge der Genomprojekte zielten bisherige wissenschaftliche Arbeiten häufig auf die Analyse von kodierenden DNA-Regionen. Im Fokus dieser Arbeit steht hingegen die Analyse der intergenischen Bereiche vor allem im Bereich des Interferon-Genclusters im Vergleich zwischen Mensch und Maus und Schimpanse. S/MAR-Elemente wurden identifiziert und ihre Kernmatrix-Bindungseigenschaften miteinander verglichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche S/MAR Konstrukte mit einem Duplex-Insulator-Konstrukt an fünf verschiedenen definierten genomischen Integrationsorten miteinander verglichen. Ein neues Verfahren, um DNA-Kernmatrix Interaktionen in situ beobachten zu können, ist die Halo-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (Halo-FISH). Der Assoziationsstatus von Genen an der Kernmatrix kann Aufschluss über die transkriptionelle Aktivität geben. Deswegen sollte unter anderem der transkriptionell aktive Zustand von o.g. Klonen untersucht werden. Der Integrationsmechanismus von Retroviren wird mit der Kernarchitektur in Zusammenhang gebracht, die ihrerseits die Transkriptionseigenschaften der Proviren determiniert.

Eukaryotic DNA is organized into chromatin domains that regulate gene expression and chromosome behavior. Insulators and/or scaffold-matrix attachment regions (S/MARs) mark the boundaries of these chromatin domains where they delimit enhancing and silencing effects from the outside. S/MARs were discovered 2 decades ago, when they were first defined as DNA elements that either remain at the nuclear skeleton after the extraction of histones and other soluble factors in a halo-mapping approach or reassociate with a scaffold or matrix preparation with high affinity in vitro. Halo fluorescence in situ hybridization (halo-FISH) studies confirm that S/MARs act by organizing eukaryotic chromatin into separate loops. Following histone extraction, these loops can be visualized as a DNA halo anchored to the densely stained nuclear matrix or chromosomal scaffold. At a molecular level, S/MAR elements interact with constitutive of the nuclear matrix. By recombinase mediated cassette exchange (RMCE), different types of bordering elements at a number of predefined genomic loci were combined. Flanking an expression vector with either S/MARs or two copies of the non-S/MAR chicken hypersensitive site 4 insulator demonstrates that while these borders confer related expression characteristics at most loci, their effect on chromatin organization is clearly distinct. Despite the rapid progress in sequencing eukaryotic genomes, our current abilities to interpret sequence information are still limited. In this work the INF gene-cluster of human, chimp and mouse was compared. S/MARs were identified and compared in matrix association assays. Integration is an obligatory replication step for all retroviruses. Recent studies in cell lines have shown that retroviruses and retroviral vectors integrate not randomly into their host genome. In this work it was shown via halo-FISH technic that in human leukocytes after SIV infection there is a single copy integrate detectable at the nuclear matrix.

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Winkelmann, Silke: Dynamische Aspekte der Kernarchitektur: S/MARs und ihre Rolle bei der Etablierung aktiver Transkriptionseinheiten. 2007.

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