Untersuchung der Genexpression in Aspergillus niger mittels Echtzeit-PCR

Jungebloud, Anke

Inhalt: Der Pilz Aspergillus niger wird zur biotechnologischen Herstellung von homologen und heterologen Proteinen eingesetzt und gewinnt als Produzent von rekombinanten Proteinen immer mehr an Bedeutung. Die Kontrolle und Beurteilung solcher biotechnologischen Prozesse erfolgt derzeit ausschließlich über die Menge an gebildetem Protein. Die Kontrolle und Beurteilung dieser Produktionsprozesse erfordern allerdings eine ganzheitliche Betrachtung der Produktbildung. Hier wird eine Methode vorgestellt, mit welcher die Produktbildung bei A. niger bereits auf genetischer Ebene anhand der Menge der für das Zielprotein kodierenden mRNA beurteilt werden kann. Die Menge dieser produktspezifischen mRNA ist dabei ein Maß für die Genaktivität der Pilzzellen für ein bestimmtes Protein. Diese auf der Echtzeit-PCR basierende Methode zur Quantifizierung von mRNA setzt sich aus mehreren Schritten zusammen, die hier ausführlich beschrieben werden. Um die Genauigkeit der Quantifizierung einschätzen zu können, wurden die Schritte der Probenaufbereitung hinsichtlich ihrer Reproduzierbarkeit überprüft und festgestellt, dass viele variierende Faktoren eine genaue und reproduzierbare quantitative Analyse der mRNA beeinflussen können. Um dennoch mRNA reproduzierbar quantifizieren zu können, wurde ein Bezugssystem etabliert, welches die gleichen Probenaufbereitungsschritte inklusive Probenentnahme durchläuft wie die zu quantifizierende mRNA und somit alle variierenden Faktoren ausgleicht. Anhand der Produktion von Glucoamylase wurden erste quantitative Untersuchungen der produktspezifischen mRNA durchgeführt und die Bildung dieses Enzyms auf genetischer Ebene über der Kultivierung von A. niger AB 1.13 dargestellt. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass ein direkter Zusammenhang zwischen der Glucoamylasebildung und der Menge an glaA-mRNA besteht.

Abstract: The fungus Aspergillus niger is used for the biotechnical production of homologous and heterologous proteins and is becoming increasingly important as a producer of recombinant proteins. The control and assessment of such biotechnical processes currently depends on the amount of protein produced. The control and assessment of these production processes however, requires the entire production process to be examined. This is an introduction to one method, with which the production process of A. niger can already be assessed at a genetic level. This is due to the amount produced for the coding mRNA of the target protein. The amount of this product-specific mRNA can be used to measure the gene activity of a particular protein. This method for quantifying mRNA is based on real-time PCR and comprises many separate steps, which will be explained in detail. The reproducibility of sample preparation steps will be checked in order to estimate the accuracy of quantification; many varying factors can influence an accurate and reproducible quantative analysis of the mRNA. A reference system will be established, which will enable mRNA to be reproducibly quantified. This system will run through the same sample preparation steps, including sample collection, as the mRNA to be quantified, and will therefore compensate for all variables. Due to the production of glucoamylase by this fungus, first quantative analyses of the product-specific mRNA have been carried out. The formation of this enzyme on a genetic level by cultivation of A. niger AB 1.13 has been shown. It was also possible to show a direct connection between the production of glucoamylase and the amount of glaA-mRNA.

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Jungebloud, Anke: Untersuchung der Genexpression in Aspergillus niger mittels Echtzeit-PCR. 2007.

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