DNA-Microarrays zur Detektion von relevanten Antibiotikaresistenzen in Bacillus anthracis und Yersinia pestis

Antwerpen, Markus

Die Medikation von Personen nach Exposition oder zur Prophylaxe gegen hochpathogene Bakterien muss schnellstmöglich und effektiv erfolgen, wobei gemäß Empfehlungen Erreger-spezifische Antibiotika verabreicht werden. Bei B. anthracis sind dies Ciprofloxacin, Doxycyclin, Rifampin und Vancomycin; bei Yersinia pestis Ciprofloxacin, Tetracyclin, Streptomycin und Gentamicin. Da die Behandlung der infizierten Personen in der Regel im klinischen Alltag ohne vorherige Überprüfung der Resistenzeigenschaft des Erregers geschieht, wurde eine auf Microarray-Technology basierende Schnelldiagnostik entwickelt, die es ermöglicht innerhalb von 4 - 7 Stunden eine zuverlässige Aussage über vorhandene relevante genetische Resistenzdeterminanten zu treffen. Zu diesem Zweck wurden jeweils für Bacillus anthracis und Yersinia pestis ein Versuchsablauf entwickelt, der zunächst einen DNA-Anreicherungsschritt enthält, der mit einer auf den Erreger abgestimmten Multiplex-PCR realisiert wurde. Im weiteren Verlauf wird eine multiplexe enzymatisch-fluoreszente Markierungsreaktion angeschlossen und das erhaltene Produkt auf den entwickelten Microarrays hybridisiert. Mit diesen ist es nun möglich, sowohl klinisch relevante Resistenzgene nachzuweisen (tet(A-D); tet(K-O); vanA; vanB; aac3-Ia, -IIa, -IVa; ant3-Ia, -IIa; aph6’’-Id; aph3’’-Ib), als auch Resistent-vermittelnde Mutationen in den Genen gyrA, gyrB, parC bzw. rpoB. Die Evaluation der Microarrays wurde aus politischen und ethischen Gründen nicht mit resistenten B. anthracis oder Y. pestis – Stämmen durchgeführt. Die Microarrays konnten jedoch aufgrund der sehr nahen Verwandtschaft der beiden Organismen zur B. cereus ATCC10987 bzw. Y. pseudotuberculosis DSM8992 mit resistenten Isolaten dieser Spezies evaluiert werden. Dabei wurde sowohl die Detektion der Resistenzgene mit Misch-DNA resistenter Spezies simuliert, als auch die Bestimmung Resistenz-vermittelnden Punktmutationen mit zuvor isolierten und charakterisierten Mutanten geprüft. Im weiteren Verlauf wurden Kinetik und Reproduzierbarkeit der entwickelten Versuchsabläufe untersucht sowie eine Blind-Studie mit klinischen Yersinia enterocolitica Isolaten durchgeführt.

The medication of persons after exposition or for prophylaxis against highly-pathogenic bacteria must take place as fast as possible and effectively. The following antibiotics are recommended: For B. anthracis are these Ciprofloxacin, Doxycyclin, Rifampin and Vancomycin; for Yersinia pestis Ciprofloxacin, Tetracyclin, Streptomycin and Gentamicin. Treatment of infected persons is usually realized in clinical diagnostic without previous examination of resistance of the infecting species. In front of this background an assay was developed based on microarray-technology, which enables the obtaining of reliable results of existing relevant genetic resistance determinants within 4 - 7 hours. Two separate assays for Bacillus anthracis and Yersinia pestis were developed, which harbour a DNA enrichment-step, -realized by a multiplex PCR compatible with the examined species-, subsequently a multiplex enzymatic fluorescent labelling and hybridization using the developed diagnostic microarrays. Using these microarrays it is possible to detect clinically relevant resistance genes (tet (A-D); tet (K-O); vanA; vanB; aac3-Ia, - IIa, - IVa; ant3-Ia, - IIa; aph6'' - Id; aph3'' - Ib) and resistance-mediating point-mutations in genes gyrA, gyrB, parC and/or rpoB in one single step. Because of political and ethical reasons evaluation of the microarrays was not performed using resistant B. anthracis- or Y. pestis - isolates. The microarrays could be evaluated because of a strong relationship of these two organisms to the non-highly-pathogenic organisms B. cereus ATCC10987 and Y. pseudotuberculosis DSM8992. The detection of both, resistance genes and resistance-obtaining point mutations, was performed using in this study isolated and well characterized mutants or mixture-DNA of resistant species. In further process kinetics and reproducibility of the developed assay were investigated as well as a blind panel was performed using clinical Yersinia enterocolitica-isolates.

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Antwerpen, Markus: DNA-Microarrays zur Detektion von relevanten Antibiotikaresistenzen in Bacillus anthracis und Yersinia pestis. 2007.

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