Production and secretion of recombinant proteins using Bacillus megaterium

Yang, Yang

Diese Arbeit hat die systematische Entwicklung des Gram positiven Bakteriums Bacillus megaterium zum rekombinanten Proteinproduktionswirt am Beispiel einer heterologen Hydrolase aus Thermobifida fusca (TFH) und einer homologen Penicillin G Amidase aus dem B. megaterium Stamm ATCC 14945 zum Ziel. Die Produktion und Sekretion der TFH unter Kontrolle eines xyloseinduzierbaren Promoters war erst nach Anpassung des originalen tfh Gens an den optimalen B. megaterium Kodongebrauch erfolgreich. Der Stamm WH323 defizient in der Verstoffwechselung von Xylose führte durch eine langzeitige Induktion des Promoters zu höheren TFH Ausbeuten. In komplexem LB Medium wurden so in Schüttelkolbenkultivierungen 2.9 mg L-1 und im pH kontrollierten Bioreaktor 18.1 mg L-1 TFH sekretiert. In semi-definiertem A5 Medium konnten im pH kontrollierten Bioreaktor 13.9 mg TFH L-1 erzielt werden, so dass zum ersten Mal auch bei glukoselimitierter Zufütterung mit semidefiniertem Medium signifikante Proteinmengen sekretiert wurden. Schließlich führte eine kontinuierliche Kultivierung zu 12.3 mg TFH L-1. Die Produktion wurde 2.3-fach verbessert auf 421 U g CDW -1 im Vergleich zur Hochzelldichtekultivierung. Außerdem wurde die rekombinante Produktion und der Export einer Penicillin G amidase (PGA) optimiert, die bei der reversen Synthese von ß-Laktamantibiotika zum Einsatz kommt. Dazu wurde der Stamm YYBm1, dem die Gene für die extrazelluläre Protease NprM und den Xylosestoffwechsel fehlen, verwendet. Die Ersetzung des PGA Signalpeptides durch das der B. megaterium Lipase A führte zu einer 1.7 fachen Sekretionssteigerung. Weiterhin wurde ein gepuffertes Mineralmedium mit Calciumionen und dem definierten Zusatz von Aminosäuren entwickelt und bis zum 2 L Bioreaktor skaliert. Mit einer Produktion von 40 mg L-1 PGA, führte die Kombination der genetischen und Medienoptimierung zu einer 7-fachen Verbesserung. Abschließend wurde eine 30-fache Steigerung in Hochzelldichtekultivierungen erzielt.

The aim of this thesis was to systemically establish the recombinant high level production and secretion of a heterologous hydrolase from Thermobifida fusca (TFH) and a homologous penicillin G amidase from Bacillus megaterium ATCC 14945 using the Gram positive bacterium B. megaterium. Under control of a xylose inducible promoter successful TFH production was achieved by adapting the original tfh gene to the optimal codon usage of B. megaterium. The use of WH323 impaired in xylose utilization increased TFH yields via long term promoter induction. Using LB medium 2.9 and 18.1 mg TFH L-1 were secreted in shaking flask and pH controlled batch cultivation, respectively. With semi-defined A5 medium in a pH controlled batch cultivation secretion of 13.9 mg L-1 was observed. For the first time, significant protein secretion in glucose limited fed batch cultivation was achieved using a semi-defined medium. Finally, continuous cultivation led to 12.3 mg L-1 secreted TFH. Production was improved 2.3-fold to 421 U g CDW-1 compared to the production in high cell density cultivation. Next, the recombinant production and export of penicillin G amidase (PGA) which is used in the reverse synthesis of beta-lactam antibiotics were systematically improved. Strain YYBm1 lacking the extracellular protease NprM and deprived in xylose utilization was employed. The PGA leader peptide was replaced by the B. megaterium LipA counterpart, which led to an increase in secretion by 1.7-fold. Second, a buffered mineral medium containing calcium ions and defined amino acid supplements was developed and scaled up to a 2 L bioreactor. With a productivity of up to 40 mg L-1 PGA in a batch cultivation, the combination of genetic and medium optimization led to an overall 7-fold improvement. Thereby, a 30-fold improved PGA production was obtained in high cell density cultivations.

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Yang, Yang: Production and secretion of recombinant proteins using Bacillus megaterium. 2007.

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