Molecular analysis of coenzyme A ligase from benzoate-metabolizing Sorbus aucuparia cell cultures

Hussein, Ramadan

Benzoesäuren sind Vorstufen und Signalmoleküle. In dieser Arbeit lag der Schwerpunkt auf der Untersuchung der Benzoesäure-Biosynthese auf molekulargenetischer Ebene. In Elicitor-behandelten Zellkulturen von Hypericum androsaemum und Sorbus aucuparia ist die Benzoesäure eine Vorstufe für die Produktion von Xanthonen bzw. Biphenylen. Die Benzoesäure- Bildung in H. androsaemum verläuft über Zimtsäure nach einem oAabhängigen und nicht-ß-oxidativen Mechanismus. Auf der biochemischen Ebene waren bereits drei CoA-Ligasen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten bekannt. Jetzt wurden aus beiden Zellkulturen verschiedene Teilstücke von CoA-Ligase-cDNAs mittels RT-PCR kloniert. Dafür wurden von bekannten 4-Cumarat:CoA-Ligasen (4CL) degenerierte und spezifische Primer abgeleitet. Eine Volllänge-cDNA mit Homologie zu 4CL wurde aus Hefeextraktbehandelten S. aucuparia-Zellkulturen kloniert. Sie enthält einen offenen Leserahmen von 1815 Basenpaaren, der für ein Polypeptid von 605 Aminosäuren kodiert. Dieses Protein wurde erfolgreich in E. coli exprimiert, über Affinitätschromatographie aufgereinigt und mit Hydroxyzimtsäuren inkubiert. Die meisten Substrate wurden in ihre entsprechenden Hydroxyzimtsäure-CoA-Thioester überführt. Das bevorzugte Substrat war 4-Cumarsäure, gefolgt von Kaffeesäure, m-Cumarsäure, o-Cumarsäure,Ferulasäure und Zimtsäure. Folglich war das rekombinante Enzym eine 4CL.Sinapinsäure war kein Substrat. Interessanterweise zeigte das Enzym auch Aktivität mit Benzoesäuren. Benzoesäure, 2-Hydroxybenzoesäure und 3- Hydroxybenzoesäure wurden im Vergleich zu 4-Cumarsäure mit 12, 5 bzw. 7% umgesetzt. Nach unserem Wissen ist dies der erste Fall, dass eine 4CL auch Aktivität mit Benzoesäuren besitzt. Für das Substrat 4-Cumarsäure wurden folgende kinetische Werte ermittelt: Km : 9 ± 3 μM , kcat/Km : 2.6 × 104 M-1sec-1. Für CoA und ATP wurden Km-Werte von 16 bzw. 13 μM ermittelt. Auf der Basis von 4CL-Aminosäure-Sequenzen wurde ein phylogenetischer Baum erstellt. S. aucuparia-4CL gehört zur Klasse II der 4CL-Sequenzen von Angiospermen und gruppiert eng mit der 4CL-3 aus Rubus idaeus zusammen.

Benzoic acids are precursors and signal molecules. The objective of this work was to study benzoic acid biosynthesis at the molecular genetic level. In elicitortreated cell cultures of Hypericum androsaemum and Sorbus aucuparia, benzoic acid is a precursor of xanthone and biphenyl biosynthesis, respectively. Benzoic acid formation in H. androsaemum proceeds via cinnamic acid, with the underlying mechanism being CoA-dependent and non-ß-oxidative. At the biochemical level, three CoA ligases with different substrate specificities were detected. A full-length cDNA with homology to 4-coumarate:CoA ligase (4CL) was identified from yeast-extract-treated Sorbus aucuparia cell cultures using degenerate primers derived from conserved regions of 4CLs and gene specific primers for RTPCR. In addition, various partial CoA ligase cDNA sequences were cloned from both cell cultures. The full-length sequence contained a 1815 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 605 amino acids. The encoded protein was successfully expressed in E. coli and purified by affinity chromatography. Most hydroxycinnamic acids were converted to the corresponding hydroxycinnamoyl-CoA thioesters, with 4-coumaric acid being the preferred substrate, followed by caffeic, m-coumaric, o-coumaric, ferulic, and cinnamic acids. Thus, the recombinant enzyme was a 4CL. No evidence was found for the conversion of sinapic acid to sinapoyl-CoA. Interestingly, S. aucuparia 4CL also exhibited activity toward benzoic acids. Benzoic, 2-hydroxybenzoic, and 3-hydroxybenzoic acids were activated at relative efficiencies of 12, 5, and 7%, respectively, compared to the activity with 4-coumaric acid. To our knowledge, this is the first plant 4CL showing distinct activity with benzoic acids. For the preferred substrate 4-coumaric acid, the Km and kcat/Km values were 9 ± 3 μM and 2.6 × 104 M-1sec-1, respectively. The Km values for CoA and ATP were 16 and 13 μM, respectively. Based on the amino acid sequences of 4CLs, a phylogenetic tree was constructed. S. aucparia 4CL belonged to the class II angiosperm 4CL sequences and grouped closely together with Rubus idaeus 4CL3.

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Hussein, Ramadan: Molecular analysis of coenzyme A ligase from benzoate-metabolizing Sorbus aucuparia cell cultures. 2006.

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