Regulation des Serotoninrezeptor-3B-Gens: Gewebespezifische Transkription und funktionelle Analyse genetischer Polymorphismen

Meineke, Cornelia

Der -100/-102 AAG Deletionspolymorphismus (rs3831455) im 5’-Bereich des HTR3B-Gens wurde signifikant mit erhöhtem akutem Erbrechen nach emetogener Zytostatikatherapie korreliert. Die funktionelle Bedeutung dieses Polymorphismus wurde in dieser Arbeit untersucht. Dafür wurden die Transkriptionsstartpunkte des HTR3B-Gens durch rapid amplification of mRNA ends (RACE), qRT-PCR und funktionellen Promotoranalysen definiert. Außerdem wurde der funktionelle Einfluss der Deletionsvariante auf die Genexpression von HTR3B mittels Luziferase-Reportergen-Analysen und electrophoretic-mobility-shift-Versuchen (EMSA) aufgeklärt. Die RACE und qRT-PCR-Analysen zeigten, dass im Gehirn gewebespezifisch ein anderer Transkriptionsstartpunktbereich verwendet wird als im Dünn- und Dickdarm. Der Bereich in dem der Transkriptionsstartbereich des Gehirns liegt, zeigte eine Promotoraktivität in Ratten-PC-12-Zellen, humanen LAN-1- und HEK293-Zellen. Der Transkriptionsstartbereich in dem die Deletionsvariante und Transkriptionstartpunkte des Darms liegen, zeigte signifikante Promotoraktivität in HEK293-Zellen. Die Deletionsvariante selbst zeigte keinen Einfluss auf die Reportergen-Expression. Auch die 3-fach hintereinander klonierte polymorphe Region zeigte keinen Effekt der Variante auf die Promotoraktivität in HEK293-, CaCo2- und PC-12-Zellen. Die EMSA-Versuche wiesen auf eine vom Polymorphismus abhängige Proteinbindung hin. Es konnte jedoch keine Sequenzspezifität für die Bindung nachgewiesen werden. Die -100/-102 AAG Deletionsvariante liegt im nicht transkribierten Promotorbereich des HTR3B-Gens, zeigt jedoch keinen direkten Einfluss auf die Promotoraktivität. Die Variante liegt in einer Region mit eng gekoppelt vererbten Polymorphismen, was möglicherweise die Korrelation mit Zytostatika-induziertem Erbrechen erklärt. Die in dieser Arbeit erstmals beschriebenen Transkripte im Gehirn lassen die Existenz von zwei neuen Proteinisoformen der B-Untereinheit des 5-HT3-Rezeptors vermuten.

The -100/-102 AAG deletion polymorphism (rs3831455) in the 5’ region of the HTR3B gene showed significant association with increased acute vomiting during emetogenic chemotherapy. The functional effects of this polymorphism were analyzed in this work. Rapid amplification of mRNA ends (RACE), qRT-PCR and functional promoter analyses were used to define the transcriptional start of the HTR3B gene. In addition, the functional effect of the -100/-102 deletion polymorphism on the expression of HTR3B was assessed using luciferase-based reporter gene- and electrophoretic-mobility-shift-assays (EMSA). The RACE and qRT-PCR analyses suggested the existence of alternative transcriptional start site regions (TSSRs) in brain and intestine. The brain’s TSSR showed promoter activity in rat PC-12 and humans LAN-1 and HEK293 cells. The TSSR of intestine, in which the deletion polymorphism is located, showed significant promoter activity in HEK293 cells. The polymorphism by itself, however, showed no significant effect of the measured reporter gene activity. Even more, also the cloned in triplicate polymorphic region showed no effect on the promoter activity in HEK293, CaCo-2 or PC-12 cells. The EMSA experiments indicated a polymorphism dependant protein binding in the region. The sequence specificity of this binding, however, could not be confirmed. In conclusion, the -100/-102 AAG deletion polymorphism is located in the non-transcribed promoter region of the HTR3B gene, but shows no direct effect on the promoter activity. The polymorphism is situated, however, in a region of high genetic coupling that could be a possible explanation of the observed association with chemotherapy-induced emesis. The brain-specific transcripts, described here for the first time, indicate the existence of two new isoforms of the subunit B of the 5-HT3 receptor.

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Meineke, Cornelia: Regulation des Serotoninrezeptor-3B-Gens: Gewebespezifische Transkription und funktionelle Analyse genetischer Polymorphismen. 2006.

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