Untersuchungen zur Eignung von Triplehelix-bildenden und bifunktionellen Oligonukleotiden als neue Werkzeuge zur in situ-Modifizierung von Pflanzengenen

Swenty, Marco

Ziel der vorgestellten Arbeit war die Evaluierung von Triplehelix-bildenden und bifunktionellen Oligonukleotiden als neue Werkzeuge zur in situ-Modifizierung von Pflanzengenen. Aufbauend auf den im tierischen System entwickelten Grundlagen sollte die Übertragbarkeit dieser Methode auf das pflanzliche System untersucht werden. Für die Konstruktion eines Modellgens wurde ein Abschnitt aus dem Gen für die granule-bound starch synthaseI (gbssI) der Kartoffel verwendet. Dieser Abschnitt wurde mit dem Gen für das green fluorescent protein (gfp) fusioniert. Die gezielte Modifizierung eines zwischen den Gensequenzen gelegenen Stop-Codons in ein Sinn-Codon sollte die Aktivierung des ursprünglich inaktiven Modellgens bewirken. Es wurden verschiedene Varianten von Triplehelix-bildenden und bifunktionellen Oligonukleotiden erstellt. Mit Hilfe von in vitro-Versuchen konnte eine effiziente und sequenzspezifische Bindung von Oligonukleotiden an die Zielgensequenz nachgewiesen werden. Die Aufnahme verschiedener Oligonukleotide in Protoplasten nach einer Elektroporation und ihre Anreicherung im Zellkern wurden mit Hilfe der Konfocalen Laserscanningmikroskopie (CLSM) untersucht. Die rasche Anreicherung von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden im Zellkern konnte gezeigt werden. In Protoplasten aus transgenen Kartoffelpflanzen wurden Versuche zur in situ-Aktivierung einer inaktiven Variante eines gfp-Modellgens durchgeführt. Aufgrund der geringen Effizienz der untersuchten Methode im transienten Modellsystem wurde ein selektierbares Modellgen-System auf der Basis des Bialaphos-Resistenzgens (bar) entwickelt. Aufgrund unvorhergesehener Schwierigkeiten in der Etablierung des Selektionssystems konnten die mit diesem System durchgeführten umfangreichen Modifizierungsversuche nicht ausgewertet werden. Eine Praxisrelevanz Triplehelix-bildender und bifunktioneller Oligonukleotide zur in situ-Modifizierung des gbssI-Gens besteht zur Zeit nicht.

The aim of this project was the evaluation of triple helix-forming and bifunctional oligonucleotides as new tools for in situ modifications of plant genes. Based on methods established in mammalian cell systems the applicability for plant cells was investigated. For the construction of model genes a region from the granule bound starch synthaseI-gene (gbssI) of potato was used. This sequence was translational fused to the sequence from the green fluorescent protein-gene (gfp). The specific modification of a nonsense-codon between these two sequences into a sense-codon was used to activate an initial inactive form of the model gene. A series of triple helix-forming and bifunctional oligonucleotides were designed. The ability of these oligonucleotides to bind the target gene in a sequence specific manner was shown by in vitro binding assays. The uptake of oligonucleotides in living protoplasts after electroporation was evaluated by confocal laser scanning microscopy (CLSM). The rapid enrichment of fluorescent oligonucleotides in the nucleus was shown. Protoplasts from transgenic potato-plants were used for in situ-modification experiments with the aim to activate an initial inactive model gene. Because of the low efficiency of the modification method in the transient approach with the gfp-model gene a selectable test system based on the bialaphos resistance gene (bar) was developed. Unexpected problems during the use of this method in plants prevent the analysis of the large number of performed in situ modification experiments. The results of this work showed that triple helix-forming and bifunctional oligonucleotides at the present time are not applicable for the in situ modification of the potato gene gbssI.

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Swenty, Marco: Untersuchungen zur Eignung von Triplehelix-bildenden und bifunktionellen Oligonukleotiden als neue Werkzeuge zur in situ-Modifizierung von Pflanzengenen. 2005.

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