Entwicklung von flexiblen Zelllinien für die Produktion rekombinanter Proteine und Retroviren

Schucht, Roland

Die vorhersagbare und stabile Expression rekombinanter Proteine in Säugerzellen ist von großem Interesse für viele Anwendungen in der Biotechnologie. Konventionelle Methoden zur Etablierung von Klonen mit guten Produktionseigenschaften sind mit hohem Screeningaufwand verbunden. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Austauschstrategie, welche die Etablierung von Masterzelllinien mit einer austauschbaren Expressionskassette beinhaltet. Dazu wurden chromosomale Loci in HEK293, CHO-K1 und BHK-21-Zellen retroviral markiert. Die markierten Klone wurden hinsichtlich einer optimalen und stabilen Reportergenexpression untersucht und isoliert. Anschließend wurden mittels RMCE verschiedene Expressionskassetten in ausgewählte Loci integriert. Durch die Komplettierung eines Selektionsmarkers aufgrund der sequenzspezifischen Rekombination konnte der korrekte Kassettenaustausch in 90-100% der Klone gezeigt werden. Die isogenen Subklone eines Parentalklons zeichneten sich durch ein homogenes Expressionsverhalten aus. Die Stabilität und die Höhe der Expression waren allerdings von der Konstruktion und dem Aufbau der Expressionskassette beeinflusst.Die Austauschstrategie wurde ebenfalls für die Etablierung einer neuen retroviralen Produzentenzelllinie verwendet. Mehrere retrovirale Vektoren wurden spezifisch in den markierten Locus einer Masterzelllinie integriert. Es konnten hohe und vorhersagbare Virustiter mit diesen Vektoren erzielt werden.Die präzise Integration von Expressionskassetten in einen definierten chromosomalen Locus führt zu einer vorhersagbaren Expression, sowohl für die Produktion von rekombinanten Proteinen, als auch für die Generierung von Retroviren. Die Strategie ist flexibel und auf beliebige Austauschvektoren anwendbar. Die Etablierung von Produzentenzellen und des gesamten Produktionsprozesses kann so vereinfacht und die Produktion von Proteinen und therapeutischen Viren für klinische Applikationen beschleunigt werden.

Predictable and stable recombinant protein expression from mammalian cell lines is of interest for many applications in fundamental research and biotechnology. Most approaches make use of screening efforts to identify clones that lead to a high and stable production. The aim of this work was to develop a strategy that involves random tagging of chromosomal loci, screening for optimal expression and cassette exchange to integrate a new cassette at the defined pre-selected site. Due to exchange of a single vector cassette at the defined chromosomal site protein production is predictable and the cellular properties are preserved. HEK293, CHO-K1 and BHK21 cells were transduced with a tagging vector and were screened for chromosomal loci that support stable and high level expression. Cell clones were subjected to Flp mediated gene targeting with vectors coding for an IgG. Due to complementation of antibiotic resistance gene, integration into the preselected chromosomal sites was highly specific and 90-100% of selected clones showed correct cassette exchange. Isogenic subclones provided homogeneous, high and stable expression characteristics of the IgG gene. The strategy was also applied for generating a novel retroviral producer cell line in which the retroviral vector is specifically integrated into a pre-screened high level integration site. With this approach, high level and predictable virus titres were obtained with any virus vector tested. Thus, the precise integration of expression vectors into predefined chromosomal loci leads to predictable expression both for protein production and for virus generation. The strategy is flexible and applicable to any expression vector of choice. It simplifies the generation of producer cells, the establishment of the optimal production conditions and also the characterization of the producer cells. Finally, it significantly speeds up the generation of recombinant proteins and therapeutic viruses for clinical applications.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Schucht, Roland: Entwicklung von flexiblen Zelllinien für die Produktion rekombinanter Proteine und Retroviren. 2006.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export