Zeitaufgelöste Zweiphotonenlasermikroskopie zur in-vivo-Charakterisierung von Zellparametern und endogener NAD(P)H-Fluoreszenz

Peker, Bülent

Ziel dieser Arbeit ist die Weiterentwicklung von Methoden und Anwendungen für die Zweiphotonen-Rasterlasermikroskopie für spezielle biologische Fragestellungen. Die Implementierung einer auf diesem Gebiet neuen nichtiterativen biexponentiellen Auswertemethode eröffnet hierbei neue Möglichkeiten auf dem Imaginggebiet der Zweiphotonenmikroskopie. FLIM-Messungen an gezüchteten 3D-Hautkonstrukten sollen Aufschluss auf den Säurecharakter dieser Hautäquivalente geben und einen Vergleich in Bezug auf den pH-Wert erlauben. Dies ist mit speziellen Fluorophoren, die sensitiv auf den pH-Wert reagieren, geplant. Ferner sollen die Wirkungen auf den Energiestoffwechsel der insulinproduzierenden B-Zellen erforscht werden. An dem Energiestoffwechsel der Zelle sind unter anderem die Coenzyme NADH und NADPH beteiligt. Sie gehören zu den Pyridinnukleotid-Coenzymen, welche an zahlreichen biologischen Redoxprozessen beteiligt sind. So fungieren diese nicotinamidhaltigen Coenzyme in oxidierter Form als Elektronenakzeptoren und reduziert als Elektronendonoren. Diese Coenzyme können zur Fluoreszenz angeregt werden und verraten durch ihr Fluoreszenzverhalten bestimmte Bedingungen, die in der Zelle vorliegen. Dabei sind die zu erwartenden Ergebnisse von unmittelbarem biomedizinischem Interesse, da Funktionsdefekte in den B-Zellen der Pankreasinseln zum Diabetes Typ II, einer Krankheit von höchster gesundheitspolitischer Relevanz, führen. Eine besondere Art der Zweiphotonenanregung soll aufgegriffen werden, um den nutzbaren Wellenlängenbereich eines Ti:Saphir Lasers zu erweitern. Diese funktioniert mit einer so genannten Zwei-Farben Zwei-Photonen Anregung. Eine Überlagerung von Femtosekundenpulsen verschiedener Wellenlängen, könnte dabei helfen, das biologische „Energieträgermolekül“ ATP fluoreszenztechnisch in hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen.

The aim of this study is the advancement of methods and applications for the two-photon laser microscopy for special biological questions. The implementation of a non-iterative biexponential evaluation method (new in this area) opens new possibilities on the imaging-sector of the two-photon microscopy. FLIM measurements with artificial skin constructs give information on the acid character of these skin equivalents and permit a comparison regarding the pH value. Therefore special fluorophors which sensitivly react to the pH value were employed. Furthermore, the effects on the energy metabolism of the insulin-producing b-cells have been investigated. The cell metabolism involves among other things the coenzymes NADH and NADPH. They belong to the pyridinenucleotide coenzymes, which are involved in numerous biological redox processes. Thus this nicotineamide-based coenzymes in oxidized form function as electron acceptors. These coenzymes can be simultaneously excited by two photons and fluoresce. Thereby they indicate the cellular metabolic state. The results are of particular biomedical significance, since function defects in the b-cells of the pancreatic islets lead to diabetes type II. Moreover, a special two-photon two-colour method is employed to extend the wavelength range of the Ti:Sapphire laser. An overlay of femtosecond pulses of different wavelengths could help to examine the fluorescence of the biological energy carrier molecule ATP with high temporal resolution.

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Peker, Bülent: Zeitaufgelöste Zweiphotonenlasermikroskopie zur in-vivo-Charakterisierung von Zellparametern und endogener NAD(P)H-Fluoreszenz. 2006.

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