Charakterisierung und funktionelle Analyse dendritischer Zellen als Grundlage zur Immuntherapie

Macke, Lars

Dendritische Zellen (DC) stehen in vielen zellulären immuntherapeutischen Phase I bis III Studien im Mittelpunkt. Sie sind aufgrund ihrer zentralen Rolle in der Auslösung oder Unterdrückung einer spezifischen Immunantwort ein viel versprechender therapeutischer Ansatzpunkt. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden entwickelt, um für therapeutische Zwecke prinzipiell ausreichend DC zu generieren, Grundlagen für einen geschlossenen GMP fähigen Prozess zu erarbeiten, die Qualität der generierten Zellen zu überprüfen und die Stabilität im kryokonservierten Zustand zu zeigen. Als Grundlage für die Funktionalität der DC wurde die Expression des Transgens über QRT-PCR und immunrelevanter Gene über Chipanalysen nachgewiesen. Die Präsentation der Transgene auf MHC-Klasse I wurde über einen epitop-spezifischen T-Zellklon und die T-Zellaktivierung über ein Reporterepitop (FluM1-Epitop) im autologen System gezeigt. Durch die Chipanalysen konnten weitere „Marker“-Gene für die Qualitätskontrolle gefunden werden, die einerseits ausreifungsabhängig exprimiert und andererseits die Expression essentieller Stoffwechselwege zeigten. Nach Kultivierung und Induktion der Reifung betrug die Ausbeute an lebenden Zellen nach 7 Tagen zwischen 21 - 38%. Der Verlust von bis zu 70% an Monozyten während der Kultivierung konnte auf eine spontane Apoptose in den ersten 48 Stunden zurückgeführt werden, einhergehend mit einem Verlust des Oberflächenmoleküls CD14. Aus einer Leukapherese standen im Mittel ca. 2,75E+8 modifizierte kryokonservierte CD83+ reife DC für Vakzinierungsstudien zur Verfügung, ausreichend für eine gezielte individuelle Zelltherapie inklusive Qualitätskontrollen. Mit den vorgestellten Verfahren ist eine wichtige Vorraussetzung geschaffen, qualitätskontrollierte, genetisch modifizierte DC, die in Medium ohne Zusatz von tierischen Ausgangsprodukten kryokonserviert werden können, für unterschiedliche klinische Anwendungen herzustellen.

Dendritic cells (DC) are in focus of many phase I-III clinical trials as cellular immune therapeutics. They play a decisive role in the regulation of immune responses, crucial dependent on the activation status of the DC. In this thesis methods are developed to generate sufficient numbers of DC for therapeutic use, to establish the basis for a closed cultivation system under GMP conditions, to control the quality of generated cells and to demonstrate the stability in cryopreserved conditions. To describe the functionality of DC the transgenic RNA expression was measured by QRT-PCR. Genes with important immune functions were detected by DNA-microarray analysis. The MHC-class I transgenic presentation was measured by stimulation of a specific T-cell clone. The capacity for T-cell activation was determined in an autologous assay system using a reporter epitope (FluM1). Additional marker genes for quality control could be found through DNA-microarray analysis which where expressed in dependence of DC maturation. After cultivation and maturation induction, the yield of living cells after 7 days was between 21% and 38%. The loss of nearly 70% monocytes during the cultivation process could be caused by spontaneous apoptosis during the first 48h, associated with the loss of CD14 expression on the cell surface. On average, about 2,75E+8 modified cryopreserved mature CD83 expressing DC could be generated from one leukapheresis sufficient for a vaccination trial including additional quality controls. With the described methods an important prerequisite is created to produce quality controlled genetic modified DC for different clinical applications without the need of animal proteins for cryopreservation.

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Macke, Lars: Charakterisierung und funktionelle Analyse dendritischer Zellen als Grundlage zur Immuntherapie. 2006.

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