Oxygen-independent coproporphyrinogen III oxidase : Characterization of Escherichia coli HemN and investigation of proposed functional analogs

Grage, Katrin

Die sauerstoffunabhängige Coproporphyrinogen III Oxidase (CPO) katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Coproporphyrinogen III zu Protoporphyrinogen IX während der Häm- und Chlorophyllbiosynthese. Diese Arbeit befasste sich zum einen mit der weiteren Charakterisierung des Enzyms HemN aus E. coli. Darüberhinaus wurden zwei weitere Enzyme - genannt HemZ und HemZ2 - untersucht, für die eine zu HemN analoge Funktion vorgeschlagen worden war. Mit Hilfe von strukturbasierter Mutagenese wurden die Rolle des zweiten in der HemN Kristallstruktur gebundenen Moleküls S-Adenosyl-L-Methionin (SAM2) sowie die potentielle Substratbindestelle untersucht. Charakterisierung der entsprechenden Proteine ergab, dass SAM2 für die Funktion von HemN essentiell ist. Durch Mutagenese der potentiellen Substratbindestelle wurden zwei konservierte Argininreste identifiziert, die möglicherweise an der Substratbindung beteiligt sind. In einem weiteren Versuch wurde bestimmt, dass für die Bildung von einem Molekül Protoporphyrinogen IX zwei Moleküle SAM gespalten werden. Diese Stöchiometrie ist plausibel, da während der HemN Reaktion zwei Propionatseitenketten des Substrats decarboxyliert werden müssen. In einigen Organismen wurde weder die sauerstoffabhängige CPO HemF noch das sauerstoffunabhängige Enzym HemN gefunden. Für die Gene hemZ und hemZ2 wurde postuliert, dass sie für alternative sauerstoffunabhängige CPOs kodieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Proteine HemZ aus E. coli und HemZ2 aus Bacillus subtilis gereinigt und biochemisch charakterisiert. Außerdem wurden die Gene hemZ aus E. coli sowie hemZ und hemZ2 aus B. subtilis auf ihre Fähigkeit getestet, CPO-defiziente Mutanten - eine Salmonella typhimurium hemF hemN Mutante und eine E. coli hemN Mutante - zu komplementieren. Beide Ansätze zeigten keine CPO-Aktivität für HemZ oder HemZ2, was darauf schließen lässt, dass keines der beiden Gene für ein Protein mit dieser Funktion kodiert.

The Radical SAM enzyme oxygen-independent coproporphyrinogen III oxidase (CPO) catalyzes the oxidative decarboxylation of coproporphyrinogen III to protoporphyrinogen IX during heme and chlorophyll biosynthesis. This work included further characterization of Escherichia coli HemN and investigation of two proposed alternative oxygen-independent CPOs, designated HemZ and HemZ2. Structure-based mutagenesis of E. coli HemN was performed to investigate the functional role of the second S-adenosyl-L-methionine (SAM) molecule bound in the HemN crystal structure (SAM2) and the proposed HemN substrate binding site. Mutagenesis of the SAM2 binding site demonstrated that SAM2 is essential for HemN function, indicating that both SAM1 and SAM2 play a functional role during catalysis. Mutagenesis of the proposed substrate binding site led to the identification of two conserved arginine residues which were essential for HemN activity. This points to a role of these residues in substrate binding and supports the proposed substrate binding site. In addition, it was determined that two molecules of SAM are cleaved for the formation of one molecule of protoporphyrinogen IX. This stoichiometry is plausible, considering that two propionate side chains of the substrate have to be decarboxylated during the HemN reaction. Some organisms possess neither the oxygen-dependent CPO HemF nor the oxygen-independent enzyme HemN. The genes hemZ and hemZ2 have been proposed to encode alternative oxygen-independent CPOs. In this work HemZ from E. coli and HemZ2 from Bacillus subtilis were purified and biochemically characterized. In addition, the hemZ gene from E. coli and the genes hemZ and hemZ2 from B. subtilis were tested for their ability to complement two CPO-deficient mutants, a Salmonella typhimurium hemF hemN mutant and an E. coli hemN mutant. Both approaches revealed no CPO activity for either HemZ or HemZ2, indicating that neither of the two genes encodes a protein with this function.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Grage, Katrin: Oxygen-independent coproporphyrinogen III oxidase : Characterization of Escherichia coli HemN and investigation of proposed functional analogs. 2005.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export