Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension : Process Characterization and Optimization by Applying Invasive Nucleotide and Non-invasive Electronic Nose Technology

Bassani Molinas, Maria de los Milagros

Der steigende Bedarf an Milligrammmengen von rekombinanten Proteinen (r-Proteine) für die Therapie und Strukturanalyse ist der Antrieb für die Entwicklung besonders schneller Expressionssysteme, deren Maßstab möglichst einfach vergrößert werden kann. Die transiente Transfektion von Säugerzellen ist dabei eine leistungsfähige Technologie für die schnelle Produktion großer Mengen dieser r-Proteine. Dabei hängt das System jedoch von einer Vielzahl verschiedener Faktoren ab, wie der Zelllinie, ihres physiologischen Zustandes, der Art des Expressionsvektors und der Nährmedienformulierung. Des weiteren führt die Kontrolle der Bioprozessparameter und des optimalen Zustandes des Bioprozesses zu einer deutlichen Reduktion der Produktionskosten und zu einem Anstieg des Ertrages sowie zur Verbesserung der gewünschten Produktqualität. Jeweils eine Offline- und eine Online-Kontrollmethode wurden daher zur Charakterisierung und Optimierung des transienten Transfektionsprozesses von HEK293-Zellen bei Verwendung von Polyethylenimin (PEI) als Mediator der Transfektion herangezogen. Als Offline-Methode wurde die intrazelluläre Nucleotidanalyse angewandt, die sich als verlässliche Analyse des metabolischen Zustandes, des Wachstumspotenzials und des gesamten physiologischen Status der Zelle erwiesen hat. Als Online- und nicht-invasive Methode wurde mit der Anwendung einer elektronischen Nase eine vollständig neue Technologie zur Bioprozesskontrolle und zur Identifizierung charakteristischer Prozesszustände angewandt und untersucht. HEK293-Zellen wurden durch die Verwendung eines speziell hierfür neu entwickelten Nährmediums in Suspension (HEK293s) kultiviert. Das Medium ist vollständig frei von Proteinen und Komponenten tierischer Herkunft und vereinfacht darüber hinaus entscheidend den Transfektionsprozess, da Zellwachstum und Transfektion nun direkt parallel durchgeführt werden können, ohne einen Mediumwechsel durchführen zu müssen. Dies ist eine zentrale Vorbedingung für eine Maßstabvergrößerung der Technik hin zu großvolumigen Kultivierungsprozessen. Für die Evaluierung der Transfektionseffizienz wurde ein spezielles bicistronisches Plasmid unter Kontrolle des Cytomegalovirus-Promoters konstruiert. Es wurde dann zunächst die Plasmid-DNA so mit PEI kombiniert, dass eine wirtschaftlich minimale DNA-Menge verwendet werden kann. Bei einem DNA:PEI-Verhältnis von 0.50:1.50 (µg:µg) wird ein Maximum von 70 – 80 % GFP-positiver Zellen sowohl unter serumhaltigen als auch serumfreien Kulturbedingungen erreicht. HEK293s-Zellen von einer frühen (von 40 bis 77) und einer späten (von 89 bis 150) Passage wurden dann als Wirtszellen für die transiente Transfektion verglichen. Das kombinierte NucleotideTriPhosphat-Verhältnis NTP/U = [ATP+GTP] [UDP-GNAc] / [UTP+CTP] [UTP] wurde in parallelen Ansätzen während der Kultivierung und transienten Transfektion unter serumhaltigen und serumfreien Kulturbedingungen zur Prozesskontrolle und –charakterisierung herangezogen. Als Resultat zeigte sich, dass das Nucleotidverhältnis folgende Ereignisse unterschieden kann: HEK293s-Zellen von einer frühen und einer späten Zellkulturpassage; Zellen, die unter serumhaltigen Nährmedienbedingungen wachsen von solchen unter entsprechenden protein-/serumfreien; Transfizierte von untransfizierten Zellen in Kultur; Die Aufnahme des DNA:PEI-Komplexes in die Zellen (Transfektionsprozess) von der alleinigen Aufnahme von PEI. Für die nicht-invasive Technik wurde die BioNose mit der Abgaslinie des Bioreaktors verbunden und die Daten mit Hilfe der NST-Senstool-Software gesammelt und durch Anwendung multivarianter Analysemethoden wie der Principal Component Analysis (PCA) analysiert und evaluiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die BioNose charakteristische Muster erkennen kann, die spezifisch für einen speziellen Prozess sind und zeigte eindruckvoll, dass sie ein leicht zugängliches Werkzeug darstellt, die Kulturbedingungen sowohl zu überwachen und zu kontrollieren als auch zwischen verschiedenen Kulturbedingungen zu unterscheiden.

The increasing demand for milligrams of recombinant proteins (r-proteins) to be used for therapeutics and structural studies justifies the need for a rapid and scalable expression system. Transient transfection of mammalian cells is a powerful technology for the fast production of large amounts of these r-proteins. This system depends on a multitude of different factors including the cell line, its physiological state, the type of expression vector and the medium formulation. Moreover, monitoring bioprocess parameters, and control of the bioprocess at its optimal state, enable the reduction of production costs, increase the yield and maintain the quality of the desired product. Off-line and on-line monitoring methods have been used to characterize and to optimize the transient transfection process using HEK293 cells and polyethylenimine as transfection mediator. As an off-line method the intracellular nucleotide pool was used, which has been considered as a reliable tool reflecting the metabolic status, the growth potential, and the overall physiological condition of the cell. As an on-line and non-invasive method a completely new technology, the electronic nose, was applied for bioprocess monitoring and the identification of characteristic process states. HEK293 cells were cultured in suspension (HEK293s) using a completely new medium, totally free of proteins or animal-origin components, which facilitates the transfection process by allowing growth and transfection of the cells without medium exchange. This is a central pre-requisite for scaling the technology up to large volume cultivation processes. A special bicistronic plasmid was constructed under control of the cytomegalovirus promoter. The plasmid DNA was combined with polyethylenimine (PEI) using an efficient minimum amount of DNA at a DNA:PEI ratio of 0.50:1.50 (µg:µg) showing 70-80 % of GFP positive cells under serum-containing as well as serum-free culture conditions. Specific cells taken from an early (from 40 to 77) and a late (from 89 to 150) passage number were compared as hosts for transient transfection. The combined NucleotideTriPhosphate ratio expressed as NTP/U = [ATP+GTP] [UDP-GNAc] / [UTP+CTP] [UTP] was calculated in parallel during cultivation and transient transfection under serum-containing and serum-free culture conditions for process monitoring and characterization. The results showed that nucleotide ratios can be used to distinguish between: HEK293s cells from early and late passage numbers; Cells cultured under serum-containing conditions from those under protein/serum-free medium conditions; Transfected and untransfected cells in culture; DNA:PEI complex uptake (transfection procedure) from PEI uptake alone. The BioNose was connected to the off-gas line of the bioreactor cultivation. The data were collected using the NST Senstool software and evaluated applying multivariate methods such as Principal Component Analysis (PCA). The results showed, that the BioNose can generate characteristic pattern specific for a particular process being an easily accessible tool to monitor cell cultivations as well as to distinguish between different culture conditions.

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Bassani Molinas, Maria de los Milagros: Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension : Process Characterization and Optimization by Applying Invasive Nucleotide and Non-invasive Electronic Nose Technology. 2005.

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