Biochemische Charakterisierung des „dual compartment“- Proteins Raver1 : Neue Aspekte der Ligandenbindung und Regulation

Zieseniß, Anke

Raver1 ist ein ubiquitär exprimiertes Mitglied der hnRNP-Familie. In den meisten Zelltypen ist das Protein im Zellkern lokalisiert. Während der Differenzierung von Skelettmuskelzellen konnte für Raver1 eine gezielte Translokation an sarkomere Strukturen beobachtet werden. Die genaue zelluläre Funktion von Raver1 in beiden Kompartimenten ist nicht bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Raver1 Protein näher zu charakterisieren. Hierfür wurde zunächst die Expression und Aufreinigung von rekombinantem Raver1-Gesamtprotein und zwei komplementären Deletionsfragmenten erfolgreich etabliert. In verschiedenen in vitro Analysen konnte erstmalig die direkte Interaktion mit allen bisher bekannten Liganden (alpha-Actinin, Vinculin, Metavinculin und PTB (polypyrimidine tract binding protein)) belegt werden. Darüber hinaus konnte Aktin als neuer Bindungspartner von Raver1 identifiziert werden. Die Bindung wird über die C-terminale Region von Raver1 vermittelt, wobei Raver1 sowohl mit monomerem G-Aktin als auch F-Aktin interagiert. Wie viele andere Aktin-bindende Proteine bindet Raver1 an saure Phospholipide, insbesondere PIP2. Die Assoziation von Raver1 mit Aktin wird durch PIP2 negativ beeinflusst. Ein weiterer möglicher Regulationsmechanismus für Raver1 ist die Phosphorylierung, denn das rekombinante Protein wird in vitro durch PKCalpha und PKA phosphoryliert. Eine potenzielle Phosphorylierungsstelle konnte im C-Terminus identifiziert werden. Die Isolation nativer Proteinkomplexe aus undifferenzierten C2C12-Zellen, lässt vermuten, dass Raver1 auch in vivo mit Kernaktin interagiert. Vergleichende Lokalisationsstudien an Skelett-, Herz- und glatter Muskulatur implizieren, dass die nucleo-cytoplasmatische Translokation von Raver1 ein generelles Phänomen bei der Muskeldifferenzierung ist. In gestreifter Muskulatur konnte hierbei die Lokalisation von Raver1 auf die I-Z-I-Region eingegrenzt werden. In diesen Bereichen ist eine direkte Interaktion mit Aktinfilamenten möglich.

Raver1 is an ubiquitously expressed member of the hnRNP-family. In most cell types raver1 is localised in the nucleus. Upon skeletal muscle differentiation raver1 shows a translocation to sarcomeric structures. The exact cellular function of the protein in both compartments is not known to date. The aim of this work was the further characterisation of raver1 protein. For this the expression and purification of recombinant full-length raver1 and of two complementary deletion fragments was successfully established. In several in vitro analyses the direct interaction of raver1 with all known ligands (alpha-actinin, vinculin, metavinculin and PTB (polypyrimidine tract binding protein)) could be shown. Furthermore, actin was identified as a new raver1 ligand. Actin binding is mediated by the C-terminal region of raver1; raver1 interacts with monomeric G-actin and filamentous F-actin. Like many actin-binding proteins, raver1 binds acidic phospholipids, especially PIP2. The association of raver1 with actin is negatively influenced in the presence of PIP2. Phosphorylation might be another regulatory mechanism for raver1. Recombinant protein is phosphorylated by PKCalpha and PKA in vitro. A potential phosphorylation site was identified in the C-terminus. The isolation of native protein complexes from undifferentiated C2C12-cells, supports the conclusion that raver1 interacts in vivo with nuclear actin. Localisation studies using heart-, skeletal- and smooth-muscle imply that the nucleo-cytoplasmic translocation of raver1 is a general phenomenon during muscle differentiation. In striated muscle raver1-localisation is restricted to the I-Z-I-regions. In these areas a direct interaction with actin is possible.

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Zieseniß, Anke: Biochemische Charakterisierung des „dual compartment“- Proteins Raver1 : Neue Aspekte der Ligandenbindung und Regulation. 2005.

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