Gene Regulation and Signal Transduction in Arabidopsis thaliana : 1. Regulation of Chlorophyll Biosynthesis at the Level of Glutamyl-tRNA Reductase (HEMA1) 2. Signal Transduction via the Protein Phosphatase 2A (PP2A) Pathway

Fischer, Andrea

In dieser Arbeit wurde die Lichtregulation des HEMA1 Genes von A. thaliana, das für das erste Enzym dieses Syntheseweges Glutamyl-tRNA Reduktase kodiert, untersucht. Die lichtabhängige Anhäufung von HEMA1 mRNA in Keimblättern (Cotelydonen) von Arabidopsis Keimlingen konnte beobachtet werden. Promotor-Deletionsmutanten, die mit dem bakteriellen Reportergen ß-Glucuronidase (GUS) fusioniert waren, wurden sowohl mittels transienter Expressionsversuche in Protoplasten als auch in stabilen transgenen Pflanzen getestet. Der Einfluß von Licht und Dunkelheit sowie von Licht verschiedener Wellenlängen auf die Reportergenexpression wurde gemessen. Eine Promotorregion 451 bp stromaufwärts vom Translations-Startcodon, die auch verschiedene Transkriptionstartpunkte beinhalted, war ausreichend, um eine positive Lichtinduktion zu vermitteln. Diese Lichtantwort wurde sowohl mit blauem als auch mit roten Licht beobachtet. Eine mögliche Beteiligung des Phytochromsystems an der Lichtantwort wurde gefolgert. Eine zweite Promotorregion, die für die Repression der HEMA1 Genexpression in Dunkelheit verantwortlich ist, wurde identifiziert. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Prozeß von Protein-Phosphatasen 1/2A abhängig ist. Schließlich konnte ein Promotorteil mit Silencing-Funktion identifiziert werden. Diese ersten experimentellen Hinweise auf eine komplexe HEMA1-Regulation spiegeln die zentrale Bedeutung einer strikten Steuerung der Tetrapyrrolbiosynthese in Pflanzen wieder. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde die für Pflanzen schlecht verstandene regulatorische Rolle der Protein-Phosphatase 2A (PP2A) über die Durchführung eines Two-Hybrid Screens und mittels Durchmusterung einer T-DNA Mutantensammlung auf PCR-Basis untersucht. Insgesamt konnten 32 potentielle Wechselwirkungspartner für zwei der katalytischen Untereinheiten der PP2A identifiziert werden.

In this thesis, the light-mediated regulation of the A. thaliana HEMA1 gene encoding the initial enzyme of the pathway, glutamyl-tRNA reductase, was investigated. Light-dependent HEMA1 mRNA accumulation in cotelydons of Arabidopsis seedlings was observed. Promoter deletion mutants fused to the reporter gene ß-glucuronidase (GUS) were tested for transient expression in protoplasts as well as in stable transgenic plants. The influence of light and dark treatments as well as the influence of light of different wavelengths was measured. A promoter region 451 bp upstream of the translational start codon including various transcriptional start points was shown to be sufficient in mediating positive light induction. This light response was seen towards blue and red light. The possible participation of the phytochrome system was concluded. A second promoter region was found to be responsible for HEMA1 gene repression in the dark. This process was found to be dependent on protein phosphatase 1/2A. Finally, a silencing promoter part was discovered. This initial elucidation of the complex HEMA1 promoter structure reflects the central need for a tightly regulated tetrapyrrole biosynthesis in plants. In a second part of this thesis, the so far poorly understood regulatory role of protein phosphatase 2A (PP2A) in plants was investigated using a two-hybrid screen and a PCR-based screen of a T-DNA mutant collection of Arabidopsis. A total of 32 potential interaction partners for two of the catalytic subunits of PP2A in Arabidopsis were identified. Surprisingly, multiple proteins of signal transduction, transcriptional regulation and various stress-adaptive processes including osmolarity regulation and infection response were found. Furthermore, processes of protein production, folding and degradation seem to be under partial PP2A control. Finally, indications for a direct influence of PP2A on the control of metabolic pathways and the energy generating machinery were discovered.

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Fischer, Andrea: Gene Regulation and Signal Transduction in Arabidopsis thaliana : 1. Regulation of Chlorophyll Biosynthesis at the Level of Glutamyl-tRNA Reductase (HEMA1) 2. Signal Transduction via the Protein Phosphatase 2A (PP2A) Pathway. 2005.

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