Neuartige Modulare Megasynthasen aus Myxobakterien : Die Stigmatellin- und Myxochelin-Biosynthese in Stigmatella aurantiaca

Gaitatzis, Nikolaos

Neben den Actinomyceten zeichnen sich vor allem die Myxobakterien als Quelle für neuartige biologisch aktive Naturstoffe aus. Stigmatella aurantiaca produziert neben den Myxalamiden, den Myxothiazolen, den Aurachinen, die elektronentransportinhibitorisch wirken, das Stigmatellin A und die Myxocheline A und B. Bei den letzteren handelt es sich um sogenannte Eisenchelatoren vom Katecholat-Typ, welche unter Myxobakterien weit verbreitet sind. Mit der Charakterisierung der Myxochelin-Biosynthese in S. aurantiaca Sg a15 ist es erstmalig gelungen den vollständigen Stoffwechsel-Weg eines myxobakteriellen Metaboliten in vitro nachzustellen. Insgesamt 6 Enzyme darunter eine nicht ribosomale Peptidsynthetase (MxcG) mit ungewöhlichem Aufbau sind an der Biosynthese der Myxocheline beteiligt. Auf diese Weise konnte ein bislang noch nicht charakterisierter Terminationsmechanismus in der Biosynthese von nicht ribosomal synthetisierten Peptiden dargestellt werden, bei dem das enzymatisch gebundenen Thioesterintermediat durch eine einzelne katalytische Domäne über eine zweistufige Reduktion zum Alkohol überführt wird. Schließlich resultierten aus der DNA- Sequenzanalyse des Myxochelin Biosyntheseoperons aus Stigmatella aurantiaca Sg a15 Einblicke in die EisenTransportmechanismen von Myxobakterien. Bei dem aromatischen Polyketid Stigmatellin A handelt es sich um einen Elektronentransportinhibitor. Nachdem das gesamte Stigmatellin-Biosynthese-Gencluster aus S. aurantiaca Sg a15 kloniert wurde, ergaben die DNASequenzanalysen neun für modulare Typ I Polyketidsynthase codierende Gene. Durch Fütterungsexperimente wurde bestätigt, dass eines der Module während des Stigmatellin Biosynthese-Prozesses ständig iterativ verwendet wird, da zehn Acetat bzw. Propionat-Einheiten in das StigmatellinGrundgerüst inkorporiert werden. Die iterative Verwendung eines Modules verlangt eine ungewöhnliche Rückacylierung des an der Acetyl Carrier Protein-Domäne lokalisierten Thioester-Intermediates auf die ß-Ketoacyl Synthase des gleichen Proteins. Die Stigmatellin Biosynthese verläuft damit nicht co-linear zum Proteinaufbau, was dem klassischen Modell der Wirkungsweise einer bakteriellen Typ I Polyketidsynthase widerspricht. Durch Geninaktivierungen mittels gerichteter Insertion konnten neue aktive Stigmatellin-Derivate generiert werden, deren Struktur mit Hilfe von HNMR- Untersuchungen aufgeklärt wurden.

Beside actinomycetes myxobacteria is a major source for novel bioactive compounds. The electron transport inhibitors myxalamides, myxothiazoles and aurachines are produced by different strains of Stigmatella aurantiaca as stigmatellin A and the myxochelins A and B are. The myxochelins are catecholic acid containing iron chelating compounds produced by myxobacteria. In this work the task was undertaken to heterologously express the myxochelin biosynthetic machinery in Escherichia coli. By reconstituting the myxochelin biosynthesis in vitro a novel type of reductive release mechanism during non ribosomal peptide synthesis was characterized: A single enzymatic domain is responsible for two reductive rounds in which the enzyme bound thioester-intermediate is converted to the free alcohol. Additionally and for the first time the analysis of the myxochelin biosynthetic operon revealed novel insights in the iron transport mechanisms of myxobacteria. The aromatic polyketide stigmatellin A reveals a highly potent electron transport inhibitor. After cloning and analysing the stigmatellin biosynthetic operon nine type I modular polyketide synthase genes were identified. Feeding experiments showed that one of the modules has to be used constantly iterative to enable the incorporation of ten acetate and propionate units into the stigmatellin backbone. For the first time a bacterial type one polyketide synthase was described, where the biosynthesis of a polyketide was not collinear to the protein structure. This was the first contradiction to the standard model of type I polyketide synthesis. By using gene inactivations novel bioactive stigmatellin derivatives were generated. Their structures were confirmed by HNMR analysis.

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Gaitatzis, Nikolaos: Neuartige Modulare Megasynthasen aus Myxobakterien : Die Stigmatellin- und Myxochelin-Biosynthese in Stigmatella aurantiaca. 2004.

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