Entwicklung eines transkriptionell regulierten Systems zur konditionalen Immortalisierung

May, Tobias

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines transkriptionell regulierten Systems zur konditionalen Immortalisierung. Hierfür wurde der autoregulierte Vektor pRITA generiert, der auf einem bidirektionalen tet-abhängigen Promoter basiert. Dieser treibt sowohl die Expression des Simian Virus 40 Large T Antigen (TAg) als auch die des reversen Transaktivators. Mit Hilfe von pRITA konnten embryonale Mausfibroblasten immortalisiert werden, die im aktivierten Zustand immortalisiert, im reprimierten Zustand seneszent sind. Verglichen mit dem tsTAg - die Standardmethode zur konditionalen Immortalisierung - ermöglicht pRITA eine stringentere Proliferationskontrolle mit geringeren Einfluss auf die Zellphysiologie. Eine Genexpressionsanalyse von aktivierten und reprimierten pRITA-Zellen zeigte grundlegende Unterschiede beider Zustände auf, wobei die beobachteten zellulären Phänotypen molekular beschrieben werden konnten. Weiter zeigte sich, dass pRITA definiert in das Transkriptom eingreift, da bei wiederholter Induktion identische Veränderungen im Expressionsmuster der Zelle hervorgerufen wurden. Darüber hinaus wurde mit der "DNA-Chip"-Analyse demonstriert, dass die reprimierten pRITA-Zellen nicht primären Zellen ähneln. Somit ermöglicht pRITA die Inaktivierung des immortalisierenden Gens und dessen Effekten, aber die Onkogeninaktivierung führt nicht dazu, dass die Zellen in den ursprünglichen primären Zustand gelangen.

The aim of the study was the generation of a transcriptionally regulated system for the conditional immortalization. Therefore the autoregulatory vector pRITA was developed. pRITA is based on a bidirectional tet-dependent promoter that at the same time drives the expression of Simian Virus 40 Large T Antigen (TAg) and the reverse transactivator. Using pRITA, mouse embryo fibroblasts were conditionally immortalized. In the activated state these cells are immortalized whereas they become senescent when TAg is inactivated. The comparison between pRITA and tsTAg- which is commonly employed for conditional immortalization - showed that (i) pRITA offers a stricter control of cell proliferation and (ii) the regulation required for tsTAg (temperature shift to 39°C) has a strong influence on the cell physiology. Gene expression profiling of activated and repressed pRITA cells revealed the enourmous differences between both states and described the observed cellular phenotype on a molecular level. Additionally it was shown that pRITA alters the transcriptome in a highly defined manner as repeated induction and repression steps had no influence on the gene expression profile. A hierarchical clustering revealed that repressed pRITA cells are not alike primary fibroblasts. pRITA allows therefore the complete inactivation of the immortalizing gene but this inactivation does not lead to the generation of primary cells.

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May, Tobias: Entwicklung eines transkriptionell regulierten Systems zur konditionalen Immortalisierung. 2005.

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