Tandem-Anordnung des duplizierten Xanthindehydrogenase-Locus in Arabidopsis thaliana: Analyse der differentiellen Genexpression und biochemische Charakterisierung der rekombinanten AtXDH1

Hesberg, Christine

Die Xanthindehydrogenase aus Arabidopsis thaliana wurde molekularbiologisch und biochemisch untersucht. Während die meisten Organismen nur ein für Xanthindehydrogenase codierendes Gen besitzen, existieren in A. thaliana zwei nur durch 704 Basenpaare voneinander getrennte Gene in Tandem-Orientierung. Sowohl die cDNAs als auch die Proteine AtXDH1 und AtXDH2 sind zu 93 Prozent identisch und zeigen Homologien zu Xanthindehydrogenasen anderer Organismen. Während AtXDH2 mRNA konstitutiv exprimiert wird, verändert sich die AtXDH1- Transkriptmenge bei verschiedenen Stressen wie Trockenheit, Salz, Kälte und natürlicher Seneszenz. Bezogen auf die Xanthindehydrogenase-Aktivität bewirkt Salzstreß keine Veränderung, während Kälte zu einem Rückgang und Trockenheit sowie Seneszenz zu einem Anstieg der Enzymaktivität in Blättern führen. AtXDH1 wurde in Pichia pastoris exprimiert, aufgereinigt und biochemisch untersucht. Das AtXDH1-Protein ist ein Homodimer von 300 kDa und besteht aus identischen Untereinheiten. Wie Xanthindehydrogenasen anderer Organismen setzt AtXDH1 hauptsächlich Hypoxanthin und Xanthin als Substrate um und wird durch Allopurinol inhibiert. AtXDH1 wurde durch gereinigte Molybdän-Cofaktor Sulfurase ABA3 aktiviert, die inaktives Desulfo in aktives sulfuriertes Enzym umwandelt. AtXDH1 existiert ausschließlich in der Dehydrogenase-Form und produziert Superoxid-Radikale. Dies deutet auf eine Beteiligung des Enzyms an Prozessen hin, die reaktive Sauerstoffspezies erfordern.

Xanthine dehydrogenase from the plant Arabidopsis thaliana was analyzed on molecular and biochemical levels. Whereas most other organisms own only one gene for xanthine dehydrogenase A. thaliana possesses two genes in tandem orientation spaced by 704 base pairs. The cDNAs as well as the proteins AtXDH1 and AtXDH2 share an overall identity of 93 percent and show high homologies to xanthine dehydrogenases from other organisms. Whereas AtXDH2 mRNA is expressed constitutively, alterations of AtXDH1 transcript levels were observed at various stresses like drought, salinity, cold, and natural senescence. With regard to xanthine dehydrogenase activities salt treatment had no effect, cold stress caused a decrease, but desiccation and senescence caused a strong increase of activities in leaves. AtXDH1 was expressed in Pichia pastoris, purified, and used for biochemical studies. AtXDH1 protein is a homodimer of about 300 kDa consisting of identical subunits. Like xanthine dehydrogenases from other organisms AtXDH1 uses hypoxanthine and xanthine as main substrates and is strongly inhibited by allopurinol. AtXDH1 could be activated by the purified molybdenum cofactor sulfurase ABA3 that converts inactive desulfo into active sulfoenzymes. AtXDH1 exists in the dehydrogenase form only and is able to produce superoxide radicals indicating it might also be involved in processes that require reactive oxygen species.

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Hesberg, Christine: Tandem-Anordnung des duplizierten Xanthindehydrogenase-Locus in Arabidopsis thaliana: Analyse der differentiellen Genexpression und biochemische Charakterisierung der rekombinanten AtXDH1. 2004.

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