Charakterisierung von PREL1 (Proline Rich EVH1 Ligand 1)

Jenzora, Andrea

Ena/VASP Proteine sind wichtige Modulatoren in der Regulation der Zellbewegung und lokalisieren in Fokalkontakten, Stressfasern, der lamellipodialen Spitze und der filopodialen Spitze. Zyxin und Vinculin sind prolinreiche Proteine, die in der Rekrutierung von Ena/VASP Proteinen über deren EVH1 Domäne in fokale Adhäsionen und Stressfasern beteiligt sind. Die Bindungspartner der Ena/VASP Proteine an der lamellipodialen Spitze und die Regulation ihrer Rekrutierung in diese protrusiven Strukturen ist bisher unklar. Mit einem monoklonalen Antikörper gegen das prolinreiche Erkennungsmotiv der EVH1 Domäne wurde eine HeLa Expressionsbibliothek durchsucht. Dabei wurde ein neues prolinreiches Protein mit großer Ähnlichkeit zum C.elegans Protein MIG-10 identifiziert, welches von mir als PREL1 (Proline Rich EVH1 Ligand) bezeichnet wurde. PREL1 ist ein Protein von ca. 74 kDa und fast ubiquitär exprimiert. Es zeigt Homologien zur Familie der Grb7/10/14-Signaladaptoren und weist neben vielen prolinreichen Abschnitten im N-und C-Terminus, eine RA (Ras Assoziations) und eine PH (Pleckstrin Homolgie) Domäne auf. In pull down Experimenten und Peptid Scans konnte ich eine Interaktion von PREL1 mit Ena/VASP Proteinen und den SH2/SH3 Adaptor Proteinen Grb2 und Nck zeigen. Zusätzlich kolokalisiert PREL1 mit Ena/VASP Proteinen an der lamellipodialen Spitze und in Fokalkontakten nach Ras-Aktivierung. Weiterhin konnte ich zeigen, dass PREL1 an die kleine GTPase Ras in Abhängigkeit von Lipiden bindet. Diese Daten deuten darauf hin, dass PREL1 eine Verbindung zwischen dem Ras Signalweg und dem Aktinzytoskelett während Prozessen wie Zellmigration und Zellausbreitung darstellt.

Ena/VASP family proteins are important modulators in the regulation of cell migration and localize to focal adhesions, stress fibres and the very edge of lamellipodia and filopodia. Zyxin and vinculin are proline-rich proteins involved in the recruitment of Ena/VASP proteins via their EVH1 domains to focal adhesions and stress fibres. However, it remained unclear, which interaction partners Ena/VASP proteins may have at lamellipodia tips and how their recruitment to such protrusions is regulated. A monoclonal antibody generated to recognize the proline-rich EVH1-binding consensus stained lamellipodia tips and focal adhesions in migrating fibroblasts and was employed for the screening of a HeLa expression library. We identified a novel protein with high similarity to the C. elegans MIG-10 protein which we termed PREL1 (Proline Rich EVH1 Ligand). PREL1 is a ubiquitously expressed 74 kDa protein and shares homology with the Grb7/10/14-family of signalling adaptors. Besides multiple proline-rich motifs in the N- and C-terminus the protein comprises a RA (Ras-assocation) and a PH (Pleckstrin homology) domain. Pull-down assays and peptide scan overlays revealed its interaction with proteins like Mena and Grb2 implicating it in a pathway leading to receptor mediated cell migration. Additionally PREL1 binds directly to and co-localizes with Ena/VASP proteins at lamellipodia tips and in focal adhesions in response to Ras activation. Moreover, I provide evidence that PREL1 directly binds to activated Ras in a phosphoinositide-dependent fashion. Together, my data pinpoint PREL-1 as potential first direct link between Ras and cytoskeletal remodelling during cell migration and spreading.

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Jenzora, Andrea: Charakterisierung von PREL1 (Proline Rich EVH1 Ligand 1). 2004.

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