Identifizierung und Charakterisierung des Tubulysin-Biosynthesegenclusters aus dem Myxobakterium Angiococcus disciformis An d48

Sandmann, Axel

Myxobakterien produzieren eine große Vielfalt von biologisch aktiven Sekundärmetaboliten. In Kulturextrakten des Myxobakteriums A. disciformis An d48 konnten der Elektronentransport-Inhibitor Myxothiazol, der Proteinbiosynthese-Inhibitor Angiolam und das Mikrotubuli destabilisierend wirkende Tubulysin detektiert werden. Diese Verbindungen scheinen durch Hybrid-Enzymkomplexe aus Polyketidsynthasen und nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen synthetisiert zu werden, deren Existenz kürzlich in Myxobakterien nachgewiesen wurde. Die Tubulysine sind Peptide, die ungewöhnliche Aminosäuren enthalten und sich durch eine hohe zytostatische Wirkung gegen Säuger-Zellinien mit einem IC50 im pikomolaren Bereich auszeichnen. Da die Tubulysine nur in sehr geringen Mengen gebildet werden (1-4 mg/l) musste eine Detektionsmethode für Tubulysin negative Mutanten etabliert werden, um das entsprechende Biosynthesegencluster identifizieren zu können. 1200 Mutanten konnten durch das Mariner abgeleitete Transposon pMycoMar erzeugt werden. Die Kulturextrakte dieser Mutanten wurden neben einem Bioassay mittels DAD gekoppelter HPLC-Analyse untersucht. Für insgesamt vier Mutanten konnte durch Reisolierung der Vektoren gezeigt werden, dass die Transposition in das korrespondierende Tubulysin Biosynthesegencluster stattgefunden hat, welche anschließend sequenziert wurde. Durch die Sequenzauswertung des Genclusters konnte der ungewöhnliche Aufbau eines Hybrids aus Polyketidsynthasen und nicht ribosomalen Peptidsynthetasen aufgezeigt werden, das eine Vielzahl bisher unbekannter Eigenschaften aufweist.

Myxobacteria produce a wide variety of secondary metabolites with biological activity. The electron transport inhibitor myxothiazol, the protein biosynthesis inhibitor angiolam and the tubulin destabilising agent tubulysin were detected in the culture broth of A. disciformis An d48. These compounds made by hybrids of polyketide synthases and non-ribosomal peptide synthetases, the biosynthetic combination of which has been detected in myxobacteria recently. The tubulysins are peptides bearing unusual amino acids and show high cytostatic activity against mammalian cell lines with IC50 values in the picomolar range. Due to the low production range of the tubulysins (1-4 mg/l) a detection system for tubulysin negative mutants had to be developed for the search of the corresponding biosynthetic genes. 1200 mutants were generated using the Mariner based transposon pMycoMar. In addition to the bioassay these mutants were analysed with diode array coupled HPLC. The transposition sites of four tubulysin negative mutants were identified by vector recovery which led to the identification and the sequencing of the corresponding core biosynthetic gene locus. Sequence analysis reveals an unusual multimodular hybrid polyketide synthase/peptide synthetase assembly line with a variety of unprecedented features.

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Sandmann, Axel: Identifizierung und Charakterisierung des Tubulysin-Biosynthesegenclusters aus dem Myxobakterium Angiococcus disciformis An d48. 2004.

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