Charakterisierung einer Esterase aus Paenibacillus pabuli M1 mit biochemischen und molekularbiologischen Methoden

Detering, Katja

Esterasen und Lipasen (E.C. 3.1.1.1 und 3.1.1.3) besitzen gemeinsam die Fähigkeit, Fettsäuren aus Triglycerid-Molekülen zu spalten. In diesem Zusammenhang werden eine Vielzahl von Bakterien als lipolytisch-aktive Organismen beschrieben. Dazu gehört u.a. der in dieser Arbeit untersuchte Vertreter der Art Paenibacillus pabuli. Lipolytische Aktivität tritt an einer Lipid-Wasser Grenzschicht auf und führt zu Interesterifikation von Triglyceriden, zu Mono- und Diglyceriden, Fettsäuren und in einigen Fällen zu einer Freisetzung von Glycerin. Die Entwicklung eines biochemischen Assays, das die Aktivität extrazellulärer Enzyme im Kulturüberstand detektierte, lieferte einen Eindruck über die Diversität der umgesetzten Enzymsubstrate. Es wurden Enzymkinetiken unter Verwendung eines sehr breit angelegten Spektrums von Fettsäurenverbindungen (C4:0 bis C18:1) durchgeführt. Daraus ließen sich Profile für die Kettenlängenspezifität sowohl im Rohextrakt als auch im Kulturüberstand des untersuchten Organismus erstellen, die deutlich den Umsatz bestimmter Fettsäuren im kurz- und mittelkettigen Bereich veranschaulichten (C-Atome < 12). Unter Berücksichtigung dieser Daten und der gängigen Definition konnte das vorliegende Enzym aus Paenibacillus pabuli M1 eindeutig als Esterase klassifiziert werden. Die Anfertigung einer Genbibliothek lieferte die Nukleinsäure-Sequenz des Esterase-Gens. Nach Festlegung eines Open Reading Frames (ORF) erfolgte die Translation in die Aminosäure-Sequenz. Mehrere Parameter charakterisieren das untersuchte Enzym als einen eindeutigen Vertreter der Familie VIII nach Arpigny und Jaeger (1999), in der ausschließlich Esterasen zusammengefaßt werden, die hohe phylogenetische Verwandschaft zu beta-Lactamasen und DD-Peptidasen aufweisen.

Both esterases and lipases (E.C. 3.1.1.1 and 3.1.1.3) are characterised by their capability to catalyse the hydrolysis of triacylglycerols. In this connection a great number of bacteria, like Paenibacillus pabuli M1 are described as lipolytic-active organisms. Lipolytic activity occurs at a lipid-water interface and leads to interesterification of triacylglycerols, the releasing of mono- and diacylglycerols, fatty acids and sometimes free glycerol. In order to establish a biochemical assay it was shown, that the esterase of Paenibacillus pabuli M1 revealed highest activity towards alpha-naphthol-caprylate (C8:0) and a significant preference for esters of short- and middle chain fatty acids (C-atoms < 12). Enzyme kinetics were performed by utilising a broad range of fatty acid-compounds (C4:0 to C18:1). These data led to substrate profiles in the crude cell extract and the culture supernatant of Paenibacillus pabuli M1. The preference for short- and middle chain fatty acids characterises this lipolytic enzyme as a true esterase. In contrast, lipases are defined by their capability to catalyse the hydrolysis of long-chain acylglycerols (C-atoms > 10). A molecular approach by performing a gene library of Paenibacillus pabuli M1 led to the nucleotide sequence of the esterase encoding gene. The detected open reading frame (OPF) consists of 1134 nucleotides, while the deduced amino acid sequence shows a length of 378 residues. Furthermore some common features revealed highest similarity towards members of the enzyme family VIII (Apigny and Jäger, 1999). All included enzymes are characterised as esterases with great phylogenetic relationship to beta-lactamases and DD-peptidases.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Detering, Katja: Charakterisierung einer Esterase aus Paenibacillus pabuli M1 mit biochemischen und molekularbiologischen Methoden. 2004.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export