Leishmania donovani Tryparedoxin Peroxidase

Kansal-Kalavar, Sonia

Leishmanien sind intrazelluläre Parasiten, die für die Krankheit Leishmaniasis verantwortlich sind. Die Suche nach Therapieansätzen ergab, dass der Trypanothione-vermittelte Hydroperoxide-Metabolismus die "Achilles-Sehne" dieser Trypanosomatiden ist, da sie dem Angriff von ROS (Reactive Oxyzen Species) ausgesetzt sind, die dem aeroben Stoffwechsel des Parasiten selbst und dem Abwehrsystem des Wirtes entstammen, und eine sehr begrenzte Kapazität besitzen, oxidativen Stress zu verkraften. Der Trypanothione-vermittelte Zyklus besteht aus drei Oxidoreduktasen, die in Folge arbeiten; um die Reduktionsäquivalente von NADPH auf ein Hydroperoxid zu übertragen. Das letzte Enzym der Kaskade ist die Tryparedoxin- Peroxidase. Dies wurde erstmals von Nogoceke et al im Jahre 1997 in dem Insekten-Pathogen Crithidia fasciculata nachgewiesen. Eine partielle genomische Bibliothek wurde konstruiert und mit einem PCR -Fragment von 270 Basenpaaren gescreent. Dieses Fragment war wiederum ein PCR-Produkt,das aus genomischer DNA von L. donovani mit Hilfe von Primern gewonnen worden war, die für hochkonservierte Regionen von Peroxiredoxinen mit bekannter Peroxidase-Aktivität kodieren. Mit diesen Hilfsmitteln wurde ein offenes Leseraster gefunden, das für ein Protein mit deutlicher Homologie zu Peroxiredoxinen kodiert. Das Protein wurde heterolog exprimiert und die Kinetik studiert. Diese Arbeit zeigt erstmals die Präsenz einer Tryparedoxin-Peroxidase in dem tödlichen Erreger Leishmania donovani. Auch das Reaktionszentrum (active site) des Enzyms wurde untersucht. Zu diesem Zweck wurden 10 Mutanten auf der Basis eines multiplen Sequenz-Alignments und funktioneller Überlegungen konstruiert und hergestellt. Die Untersuchung der Mutanten ergab, dass in Tryparedoxin-Peroxidasen eine neuartige katalytische Triade existiert, in der ein N-terminal konserviertes Cystein durch Wasserstoff-Brücken-Bindung mit der OH-Ggruppe eines Threonins und duch die Guanidino-Gruppe eines Arginins aktiviert wird.

Leishmania is an intracellular parasite responsible for the group of Leishmaniasis diseases. The quest for a therapy has led many researchers to believe that the trypanothione-mediated hydroperoxide metabolism is the Achilles heel for these trypanosomatids, since they are exposed to ROS (Reactive Oxygen Species) both endogenously and exogenously and possess very limited systems to cope up with this oxidative stress. This pathway comprises of a cascade of three oxidoreductases acting in sync to transfer reducing equivalents from NADPH to the hydroperoxides; the terminal being Tryparedoxin Peroxidase which was first elucidated in the insect-infecting pathogen, Crithidia fasciculata by Nogoceke et al in 1997. Screening of a partial genomic library with a 270 bp fragment obtained from the PCR on L. donovani genomic DNA with primers designed from highly conserved regions of peroxiredoxins gave a sequence that showed high homology to known peroxidases of peroxiredoxin type. The protein was expressed and kinetics were studied. Therefore, this work clearly shows the presence of Tryparedoxin Peroxidase in the deadly human pathogen, Leishmania donovani. Also the study of the active site residues would enable the design of rational drug inhibitors. To this end, ten mutants were designed based on multiple sequence alignments and some intelligent derivations. The mutants indicated that in this enzyme the catalytic triad comprises of three residues- wherein the N-terminal cysteine is activated by hydrogen bonding with the -OH group of a threonine and forced into dissociation by the guanidino group of arginine.

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Kansal-Kalavar, Sonia: Leishmania donovani Tryparedoxin Peroxidase. 2004.

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