Untersuchungen zur Struktur und Funktion der Plasminogen-bindenden alpha-Enolase aus Streptococcus pneumoniae und der Tubulin-Tyrosin Ligase aus Sus scrofa

Ehinger, Stefanie

1. Die a-Enolase aus Streptococcus pneumoniae Das humanpathogene Bakterium Streptococcus pneumoniae interagiert im Infektionsprozess mit Komponenten des Serums und der extrazellulären Matrix. Die a-Enolase, innerhalb der Bakterienzelle ein Glykolyseenzym, bindet darüber hinaus als Oberflächenprotein der Pneumokokken an das humane Zymogen Plasminogen, wodurch die Migration des Bakteriums in tiefere Gewebeschichten des Wirtes eingeleitet wird. Die a-Enolase wurde heterolog in E.coli produziert, gereinigt und kristallisiert. Die Struktur des Enzyms wurde durch Molekularen Ersatz gelöst. Bei einer Auflösung von 2.0 Å wurde erstmals die Struktur einer Plasminogen-bindenden und zudem oktameren Enolase beschrieben. Weitrhin wurden die auf Aminosäureebene bekannten Plasminogen-Bindungsstellen lokalisiert. Bindungsstudien zur Interaktion der a-Enolase mit den verschiedenen Plasminogenteilfragmenten Kringle 1-3, 1-4 und 1-5 zeigten, dass das Teilfragment Kringle1-5 des humanen Plasminogens die höchste Affinität für die a-Enolase besitzt. 2. Die Tubulin-Tyrosin Ligase aus Sus scrofa Die Tubulin-Tyrosin Ligase ist eine Peptidligase, die in tRNA-unabhängiger Weise ein Tyrosin an den C-Terminus von alpha-Tubulin anfügt. Das Enzym bildet dabei einen Komplex mit dem löslichen alpha/beta-Tubulin. Durch den Austausch der Cysteine 71, 91, 238, 244, 294 und 347 gegen Serin konnten erstmals Kristalle mit einem Beugungsvermögen von 3.3 Å erzeugt werden. Kristalldefekte erlaubten es jedoch nicht, diese für die Röntgenstrukturanalyse zu verwenden. Aktivitätsuntersuchungen der multiplen Cystein-Mutanten zeigten, dass Austausche von Cystein 294 und 338 die Aktivität des Enzyms herabsetzen und diese daher möglicherweise in der Nähe des aktiven Zentrums liegen. Die TTL ist ein proteaseempfindliches Enzym mit einer geringen Löslichkeit. Komplexierungsstudien der TTL mit Fab-Fragmenten des monoklonalen Anti-körpers ID3 zeigten, dass mit dieser Methode die Löslichkeit des Enzyms wesentlich erhöht werden konnte. Der Antikörper bindet einen der proteaseempfindlichen Bereiche und eignet sich daher besonders zur Herstellung einer homogenen Proteinprobe für die Kristallisation. Zudem wurde im Rahmen der Arbeit mit der Isolierung und Kristallisation des Komplexes zwischen der TTL und alpha/beta-Tubulin als Basis für die Strukturaufklärung begonnen.

1. a-Enolase from Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae is a human pathogenic microorganism interacting with components of serum and extracellular matrix. In Streptococcus pneumoniae the glycolytic a-Enolase doubles as a surface-displayed plasminogen-binder supporting virulence. The a-Enolase was cloned, purified, crystallized and solved by molecular replacement. It is the first crystal structure of both a plasminogen-binding and of an octameric enolase. Established plasminogen-binding sites were localized. Furthermore, binding analysis of interaction between a-Enolase and various plasminogen fragments was investigated. 2. Tubulin-tyrosine ligase from Sus scrofa The enzyme Tubulin Tyrosine Ligase is important for the posttranslational modification of tyrosine resulting in the detyrosination/tyrosination cycle. This modification involves the ribosome-independent re-addtion of a tyrosine at the C-terminus of alpha-tubulin by the tubulin-tyrosine ligase. By replacement of residues C72, C91, C238, C244, C294 and C347 by serin crystals were obtained that diffract X-rays to 3.3 Å resolution. Insolvable problems in single crystal production however prevented the structure determination. The replacement of both cysteine 294 and 338 leads to complete loss of ligase activity. The Tubulin Tyrosine Ligase is highly susceptible to proteolytic degradation reducing solubility. Complexation studies with Fab-fragments of monoclonal antibody ID3 resulted in a highly soluble complex suitable for further crystallization experiments. Furthermore, isolation and crystallization of the complex between Tubu-lin Tyrosine Ligase and the substrate alpha/beta-Tubulin was investigated.

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Ehinger, Stefanie: Untersuchungen zur Struktur und Funktion der Plasminogen-bindenden alpha-Enolase aus Streptococcus pneumoniae und der Tubulin-Tyrosin Ligase aus Sus scrofa. 2004.

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