Die Auswirkungen pathogener Mutationen im Lamin A/C-Gen und siRNA-Untersuchungen in humanen Kulturzellen

Bechert, Kim Rita

Molekular-genetische Untersuchungen bei Patienten mit Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD) und der partiellen familiären Lipodystrophie, Typ Dunnigan (FPLD), ergaben, dass diese Erkrankungen auf Mutationen im LMNA-Gen zurückzuführen sind. Es wurden drei Mutationen ausgewählt, um die Auswirkungen der Mutationen auf das Lamin A-Protein und seine Interaktions- und Assoziationpartner in humanen Zelllinien zu untersuchen. Zwei der Mutationen (G465D und R482L) wurden bei EDMD-Patienten gefunden und die dritte (R527P) bei FPLD-Patienten. Die Mutationen wurden durch Mutagenese PCR in Flag markierten Lamin A-Wildtyp-Konstrukten eingeführt. HeLa-Zellen wurden anschließend mit den Mutanten- und Wildtyp-Konstrukten transfiziert. Lamin A akkumulierte im Zellkern zu Aggregaten, wobei 72 Stunden nach Transfektion doppelt so viele Mutanten- als Wildtyp-Zellen Aggregate aufwiesen. Die Mutanten-Konstrukten wurden 10-24fach überexprimiert, das Wildtyp-Konstrukt 20fach. Lamin C, B1 und B2, Nup153, LAP2 und Emerin wurden in die Aggregate rekrutiert, was zu einer Abnahme dieser Proteine in der Kernperipherie führte. Die Aggregate der Mutanten-Zellen waren deutlich größer als die der Wildtyp-Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aggregat-Bildung teilweise auf die Überexpression zurückzuführen ist und dass es aber auch deutliche Mutanten spezifische Effekte gibt. Die Reduktion der Genexpression von Lamin A/C und Emerin durch siRNAs gezeigte, dass die Methode der RNA-Interferenz vermittelt durch siRNAs als Mittel für die funktionelle Genanalyse in kultivierten Zelllinien erfolgreich eingesetzt werden kann and dass Lamin A/C und Emerin in Kulturzellen nicht essentiell sind.

Molecular genetic examinations of patients with Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) and the partially familial lipodystrophy, type Dunnigan (FPLD), showed that these diseases result from mutations in the LMNA gene. Three mutations were chosen to examine the effects the mutations have on the lamin A protein, as well as on its interaction- and association-partners in human cell lines. Two mutations (G465D and R482L) are found in patients with EDMD and the third (R527P) in patients with FPLD. The mutations were introduced into FLAG tagged lamin A wild type constructs by site-directed mutagenesis. HeLa cells were subsequently transfected with the mutant and wild type constructs. Lamin A accumulated into aggregates within the cell nucleus, and at 72 hours after transfection double the number of mutant cells showed aggregates compared to the wild type cells. The mutant constructs were overexpressed 10-24 fold, the wild type construct 20 fold. Lamin C, B1 and B2, Nup153, LAP2 and emerin were recruited into the aggregates leading to a decrease of these proteins at the nuclear rim. The aggregates in the mutant cells were distinctly larger than those in the wild type cells. These results show that aggregate formation is in part due to overexpression, but that there are also obvious mutant specific effects. The reduction of gene expression of lamin A/C and emerin using specific siRNAs showed that the RNA interference mediated by siRNAs can be used as a means for functional gene analysis in cultured cells, and that lamin A/C and emerin are non essential proteins in tissue culture cells.

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Bechert, Kim: Die Auswirkungen pathogener Mutationen im Lamin A/C-Gen und siRNA-Untersuchungen in humanen Kulturzellen. 2004.

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