Die Glutamyl-tRNA Reduktase aus Escherichia coli - Rekombinante Produktion, Enzymmechanismus und biochemische Charakterisierung

Schauer, Stefan

Tetrapyrrole sind essentielle Bestandteile biologischer Systeme. Escherichia coli Glutamyl-tRNA Reduktase katalysiert im Rahmen der Tetrapyrrolbiosynthese die NADPH-abhängige Reduktion eines tRNA-gebundenen Glutamats zu Glutamat-1-semialdehyd. In der vorliegenden Arbeit gelang es erstmals das Enzym rekombinant bis zur apparenten Homogenität darzustellen. Es wurde eine spezifische Aktivität von 0.47 µmol min-1 mg-1 mit E. coli Glu-tRNA(Glu) als Substrat für das dimere Enyzm bestimmt. Der postulierte Enzymmechanismus wurde durch den direkten experimentellen Nachweis des zentralen Thioester-Zwischenproduktes bewiesen. Durch Mutagenesestudien konnte der hoch konservierte Cystein-Rest 50 als Nukleophil des aktiven Zentrums identifiziert werden. Durch kinetische Analysen mit den GluTR-Varianten R52Q und R52K in Kombination mit dem artifiziellen Substrat Gln-tRNA(Glu) konnte die zentrale Rolle von Arginin 52 für die richtige Positionierung des Substrates und für die Differenzierung zwischen Glutamat und Glutamin nachgewiesen werden. Der Vergleich von Enzymkinetiken mit in vitro synthetisierter, unmodifizierter Glu-tRNA(Glu) und modifizierter Glu-tRNA(Glu) zeigten, dass die posttranskriptionalen Modifikationen der tRNA keinen Einfluß auf die Erkennung durch die GluTR haben. Durch Co-Immunopräzipitationsstudien konnten direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen von E. coli GluRS, GluTR und GSA-AM nachgewiesen werden.

Tetrapyrrols are essential for life and therefore present in most biological systems. The first enzyme of tetrapyrrole biosynthesis, glutamyl-tRNA reductase, catalyzes the NADPH-dependent reduction of glutamyl-tRNA to glutamate-1-semialdehyde. In the present study the recombinant Escherichia coli enzyme was purified to apparent homogeneity for the first time. The dimeric enzyme showed a specific activity of 0.47 µmol min-1 mg-1 using E. coli Glu-tRNA(Glu) as substrate. The postulated enzymatic mechanism was proved by the trapping and detection of the central thioester intermediate. Mutagenesis studies identified the highly conserved Cys-50 as the active-site nucleophil. Kinetic analysis of the GluTR mutants R52Q and R52K in combination with the artificial substrate Gln-tRNA(Glu) revealed the central role of Arg-52 for the spatial arrangement of the substrate and the discrimination between glutamate and glutamine in the amino acid moiety of the aminoacyl-tRNA substrate. The comparison of enzyme kinetics with in vitro synthesized, unmodified Glu-tRNA(Glu) and fully modified Glu-tRNA(Glu) demonstrated that glutamyl-tRNA recognition by GluTR is independent of posttranscriptional modifications. Co-immunoprecipitation studies provided evidence for direct protein-protein interactions of E. coli GluRS, GluTR and GSA-AM.

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Schauer, Stefan: Die Glutamyl-tRNA Reduktase aus Escherichia coli - Rekombinante Produktion, Enzymmechanismus und biochemische Charakterisierung. 2003.

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