Production of di-D-Fructofuranose 1,2`:2:3` Dianhydride (DFAIII) using Recombinant Inulase II

Letca, Diana

Rekombinante Inulase II, die zur Biokonversion von Inulin zu DFAIII eingesetzt wird, wird intrazellulär in zwei gentechnisch veränderten Escherichia coli Stämmen akkumuliert. Fermentationsexperimente wurden in Bioreaktoren bis zu 20 L Reaktorvolumen durchgeführt, um hohe volumetrische Aktivitäten zu erzielen. Dabei wurden batch und fed-batch Strategien zur Limitierung des Kohlenstoffgehalts in der Kultur angewendet. Verschiedene Medien wurden zu diesem Zweck eingesetzt, die Hefeextrakt, Glycerin, Mineralstoffe und Vitamine in unterschiedlicher Zusammensetzung enthielten. Zur Isolierung des rekombinanten Proteins wurden verschiedene Methoden des Zellaufschlusses ausgetestet und die Aufschlußparameter variiert. Desweiteren wurde die Immobilisierung der rekombinanten Proteine an schwach-basischen Anionentauschern untersucht und die Halbwertszeit immobilisierter Inulase ermittelt. Der Einfluß von pH-Wert und Temperatur auf die DFAIII-Bildung wurde quantifiziert sowie die Michaelis-Menten-Parameter der rekombinanten Inulase II bestimmt. Abschließend wurden die löslichen und immobilisierten Enzyme charakterisiert und mit bekannten Inulasen verglichen.

Recombinant Inulase II, used for conversion of inulin into difructose dianhydride III is accumulated intracellularly in two genetically modified Escherichia coli strains. In order to obtain high volumetric activities for this enzyme, fermentation experiments up to 20 L bioreactor scale were performed, employing batch and fed-batch strategies, selected to maintain carbon-limiting conditions. Different media containing yeast-extract, glycerol, mineral elements and vitamins were investigated for this purpose. To isolate the recombinant protein, different cell disruption methods were investigated with respect to the disruption parameters. Further, the immobilization of recombinant protein on weakly basic anion-exchangers was investigated and the half-life of immobilized enzyme was established. The influence of pH and temperature over the DFAIII production was investigated and the Michaelis- Menten kinetic parameters were determined. The soluble and immobilized enzyme was finally characterized and compared with known inulase II enzymes.

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Letca, Diana: Production of di-D-Fructofuranose 1,2`:2:3` Dianhydride (DFAIII) using Recombinant Inulase II. 2003.

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