Charakterisierung der Interaktion zwischen dem Strukturprotein Filamin und der Proteinkinase C alpha

Tigges, Ulrich

Filamin A (FLNa) ist ein Strukturprotein der Zell-Matrix- Adhesionen und dient zusätzlich als Gerüstprotein zur intrazellulären Lokalisierung verschiedener signalübertragender Proteine. Die Proteinkinase C (PKC) ist eine Serin/Threonin Kinase mit Einfluss auf die Organisation des kortikalen Aktinzytoskeletts. Eine Interaktion von PKC mit FLN wurde postuliert, Details dieser Interaktion und deren Bedeutung für die Adhesions-abhängige Signalübertragung wurden bis heute nicht ermittelt. Zu Beginn dieser Arbeit wurden Yeast-two-hybrid- Analysen mit PKC als Köderprotein durchgeführt und FLN als direkter Bindungspartner der PKC nachgewiesen. Diese Interaktion ließ sich durch Ko-Immunpräzipitationsversuche unter Verwendung transfizierter HeLa-Zellen bestätigen. Anhand seriell verkürzter FLNa-Fragmente konnten zwei Bindungsregionen eingegrenzt werden. Diese Regionen zeigten in in vitro Bindungsversuchen eine Ca++- und Phospholipid-abhängige Wechselwirkung mit der regulatorischen Domäne der PKC. Die Phosphorylierung von FLN erwies sich als Isoform spezifisch, die C-Termini von Filamin A und C ließen sich in vitro durch PKC alpha phosphorylieren, der von FLNb dagegen nicht. Eine PKC-abhängige Phosphorylierung von FLN konnte auch in vivo nachgewiesen werden. Die erzielten Ergebnisse deuten auf eine Wechselwirkung von FLN und PKC in der zellulären Signalübertragung hin.

Filamin A (FLNa) is an established structural component of cell- matrix adhesion sites. In addition, it serves as a scaffold for the subcellular targeting of different signalling molecules. Protein kinase C (PKC) is a serin/threonin kinase with significance for the organisation of the cortical actin cytoskeleton. An interaction of PKC with FLN has been postulated, however, details about this interaction and its significance for cell-matrix adhesion-dependent signalling have remained elusive. In this work yeast two-hybrid analyses were performed using PKC alpha as a bait and FLN was identified as a direct binding partner of PKC alpha. The interaction was confirmed in transfected HeLa cells and serial truncation fragments of FLNa were employed to identify two binding sites on filamin. In vitro ligand binding assays revealed a Ca++ and phospholipid-dependent association of the regulatory domain of PKC with these sites. Phosphorylation of FLN was found to be isoform restricted, the C- termini of FLNa and FLNc were phosphorylated in vitro by PKC alpha, but not the C-terminus of FLNb. PKC-dependent phosphorylation of FLN was also detected in vivo. These data suggest an intimate interaction of FLN and PKC in cell signalling.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Tigges, Ulrich: Charakterisierung der Interaktion zwischen dem Strukturprotein Filamin und der Proteinkinase C alpha. 2003.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export