Impact Investigation of a Mercury Reducing GEM in Stream Microcosms & Construction of Mercury Reducing Reporter Strains Based on the Safety Strain Ps. putida KT2440

Pauling, Björg Veronika

Der Einfluss des Hg reduzierenden GVOs Pseudomonas putida KT2442::mer73 auf natürliche Bakteriengemeinschaften in Elbe Wasser und Sediment wurde in Hinblick auf sein Überleben, seinen Einfluss auf die mikrobielle Gemeinschaft (16S rDNA-TGGE Profil) und auf Gentransfer untersucht. Für diesen Zweck wurde ein Durchfluss-Mikrokosmos entworfen und auf Strömungseigenschaften hin charakterisiert. Sowohl der Effekt einer längeren Beimpfung mit niedrigen Zellzahlen als auch der Effekt eines Zellschocks wurden untersucht. Gentransfer wurde in Ab-/Anwesenheit von Phenyl Hg Acetat (PMA) untersucht. In Wasser konnte kein Überleben festgestellt werden, in Sediment konnten leicht ansteigende GEM Koloniezahlen verzeichnet werden. Weder in Wasser noch in Sediment zeigte der GEM einen Einfluss auf die natürliche mikrobielle Gemeinschaft oder konnte Gentransfer der rekombinanten Gene festgestellt werden. Trotz der hohen Hg Resistenz von Ps. putida KT2442::mer73, konnte der Stamm keine stabilen Biofilme in Laborreaktoren etablieren (von Canstein et al. 2002). Neue GVOs wurden deshalb konstruiert und auf hohe Hg Resistenz selektiert. Zusätzlich wurden sie mit Green Fluorescent Protein (GFP) ausgestattet. Dafür wurde eine promoterlose Cassette aus mer Operon und gfp in das Genom des voll sequenzierten Sicherheitsstamm Ps. putida KT2440 inseriert, wo beide Funktionen vom selben Wirtspromoter aus reguliert werden. Das GFP erlaubt so die leichte Detektion der neuen Stämme sowie eine Kontrolle der Hg Resistenz Expression über die Fluoreszenz. Der Integrationsort wurde bestimmt, um genetische Information zu erlangen, die die Entwicklung eines PCR-basierten Detektionssystems sowie Implikationen über den Phänotyp erlauben.

The impact of the Hg reducing GEM Pseudomonas putida KT2442::mer73 on the native bacterial community in Elbe River water and sediment was investigated in terms of survival and persistence, effect on community composition as depicted by 16S rDNA-TGGE patterns and gene transfer. For this purpose a stream microcosm was designed and characterised regarding its flow. Both, the effect of longterm inoculation of low GEM numbers and a cell shock with high GEM numbers were investigated. Gene transfer was studied with and without phenyl mercuric acetate (PMA) as selective pressure. Survival was not detected in water, however, a tendency to higher colony forming units (cfu) was observed in the sediment. Neither in water nor in sediment did the GEM show an effect on the indigenous bacterial population or did it transfer its recombinant genes. Although Ps. putida KT2442::mer73 was shown to be highly resistant to Hg, it failed to establish stable biofilms in laboratory scale bioreactors (von Canstein et al. 2002). New GEMs were thus constructed that were selected for high Hg resistance and were in addition provided with green fluorescent protein (GFP). A promoterless cassette consisting of the mer operon and gfp was inserted into the genome of the fully sequenced safety strain Ps. putida KT2440, so that both functions were under the transcriptional control of the same host promoter. This way, the GFP tag permits easy detection of the new strains and monitoring of Hg resistance expression through the fluorescence. The site of integration was identified to yield genetic information that could be used to develop a highly specific, PCR-based detection method. Furthermore, knowledge of the construct genotype allowed implications regarding the phenotype.

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Pauling, Björg Veronika: Impact Investigation of a Mercury Reducing GEM in Stream Microcosms & Construction of Mercury Reducing Reporter Strains Based on the Safety Strain Ps. putida KT2440. 2003.

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