Analyse der zellulären Funktion von WASP/Scar Proteinen mit Hilfe N-WASP-defekter Zelllinien

Benesch, Stefanie

Die Proteine der WASP/Scar Familie können, aufgrund ihrer Fähigkeit den Arp2/3 Komplex in vitro zu aktivieren, Aktinpolymerisation nukleieren und dabei zelluläre Signale in gerichtete Aktinpolymerisation umsetzen. Zur Analyse der Funktion von N-WASP wurden N-WASP-defekte Fibroblasten mit Hilfe des Cre/loxP Systems aus N-WASPflox/flox -Mäusen hergestellt. Zwischen N-WASPdel/del und N-WASPflox/flox Zellen waren keine morphologischen Unterschiede offensichtlich, auch nicht im Hinblick auf die Formation von Filopodien. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass N-WASP sowohl essentiell für die intrazelluläre Motilität von Shigella flexneri ist, als auch für die durch EPEC oder EHEC induzierte ‚pedestal’-Bildung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Motilität von PIP2-induzierten Vesikeln abhängig von N-WASP ist und dass bei diesem Prozess auch WIP und die SH2/SH3-Adapterproteine Nck und Grb2 beteiligt sind. Der Signalübertragungsweg, der zur Motilität dieser Vesikel führt, ähnelt dabei dem Mechanismus zur intrazellulären Motilität von Vaccinia Virus. Mit Hilfe der verschiedenen GFP-Fusionsproteine konnte auch gezeigt werden, dass nicht nur N-WASP sondern auch WASP, nicht aber Scar/WAVE die Vesikelmotilität vermitteln können. Aus den Ergebnissen der PIP2-vermittelten Vesikelmotilität ergibt sich erstmals ein eindeutiger zellulärer Phänotyp für die Inaktivierung von N-WASP, der auf eine Rolle von N-WASP bei endozytotischen oder exozytotischen Prozessen hinweist.

Proteins of the WASP/Scar family promote actin polymerisation by stimulating the actin-nucleating activity of the Arp2/3 complex in vitro. In order to analyse the cellular function of N-WASP I generated fibroblast cell lines lacking functional N-WASP from conditional N-WASP knockout mice. Within this work using the N-WASP-defective cells it was proved that N-WASP is essential for the intracellular motility of Shigella flexneri and for the formation of actin pedestals induced by EPEC or EHEC. In contrast, N-WASP-defective fibroblasts did not show any apparent morphological abnormalities not even in view of filopodia protrusion. In addition, I found that N-WASP is essential for actin assembly at the surface of endomembranes induced as a consequence of increased PIP2 and/or phosphotyrosine levels. This process resulting in the motility of intracellular vesicles at the tips of actin comets involves the recruitment of the SH2/SH3-adaptor proteins Nck and Grb2 as well as of WIP and resembles the signalling pathway involved in intracellular motility of Vaccinia Virus. In addition, vesicle motility could be fully restored in N-WASP-defective cells by ectopic expression of both N-WASP and WASP, but not Scar/WAVE. These results show for the first time a clear cellular phenotype for N-WASP loss of function and confirm a role for both N-WASP and WASP in the trafficking of at least a subset of endosomal vesicles employing the actin polymerisation machinery for movement.

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Benesch, Stefanie: Analyse der zellulären Funktion von WASP/Scar Proteinen mit Hilfe N-WASP-defekter Zelllinien. 2003.

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