Nachweissysteme zur Genexpressionsanalytik von Bakterien

Henze, Björn

Zur Optimierung der Fermentation eines rekombinanten Proteins wurde seine messenger RNA (mRNA) quantifiziert und ihr Verhältnis zu anderen mRNAs der Zelle untersucht. Von besonderem Interesse waren mRNAs, die den physiologischen Zustand der Zelle (z.B. bei Stress) widerspiegeln. Als rekombinantes Modellprotein wurde der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) gewählt, der mit Escherichia coli-Stämmen als pharmazeutisch relevantes Produkt hergestellt wird. Für die mRNA dieses Wachstumsfaktors wurden Nachweisstrategien mit verschiedenen optischen Sensoren, sowie mit Mikrotiterplattenassays entwickelt. Alle Methoden waren darauf ausgelegt, bFGF-mRNA in seiner nativen Form ohne Amplifikationsschritt nachweisen zu können. Dies erübrigt die Notwendigkeit von Markierungen oder von Polymerasekettenreaktionen zur Amplifikation. Mit DNA-Mikroarrays wurde die Expression von Genen untersucht, die in Zusammenhang mit der Produktion von bFGF, dessen Induktion oder anderen Fermentationsparametern stehen. Das BIACORE-Gerät als optischer Affinitätssensor erlaubte den Nachweis von ca. 15 µg/mL bFGF-mRNA (ca. 80 pmol/mL). Mit einem zur Detektion von bFGF-mRNA entwickelten kolorimetrischen Assay in der Mikrotiterplatte ließ sich eine untere Nachweisgrenze von ca. 5 ng/mL (27 fmol/mL) erreichen. Mit DNA-Chips wurden insbesondere die Expression von Genen betrachtet, die nach einem Hitzeschock oder nach Induktion des rekombinanten Proteins mit IPTG verstärkt oder vermindert exprimiert wurden. Es werden in der Arbeit zudem mögliche Fehlerquellen und die Reproduzierbarkeit von DNA-Mikroarray- Experimenten diskutiert.

To optimise the fermentation of a recombinant protein the messenger RNA (mRNA) was quantified and compared to that of other mRNAs of the cell. Here, mRNAs related to the physiological background of the cells were of particular interest. The basic fibroblast growth factor (bFGF) which is produced as a pharmaceutical relevant product was chosen as a recombinant model protein in Escherichia coli strains. Detection strategies were developed by using optical sensors and microtiterplate assays. The aim was to detect bFGF-mRNA in its native state without amplification and labelling. The use of DNA-microarrays yielded information about co-expressed genes when the protein production was switched on (related with the induction of bFGF or other fermentation parameters). Optical detection using the BIACORE allowed a lower detection limit for bFGF-mRNA of ca. 15 µg/mL bFGF-mRNA (ca. 80 pmol/mL). The colorimetric assay in the microtiterplate could detect bFGF-mRNA down to ca. 5 ng/mL (27 fmol/mL). The DNA-microarrays rendered information about increasingly expressed or down regulated genes after heatshock or chemical induction. Pitfalls and sources of error in DNA-microarray experiments regarding the reproducibility of the results are discussed in this work.

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Henze, Björn: Nachweissysteme zur Genexpressionsanalytik von Bakterien. 2003.

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