Die sauerstoffabhängige Coproporphyrinogen III Oxidase (HemF) aus Escherichia coli : Rekombinante Herstellung, biochemische und biophysikalische Charakterisierung

Mahlitz, Esther

Tetrapyrrole sind essentielle Bestandteile biologischer Systeme. Coproporphyrinogen III Oxidasen katalysieren im Rahmen der Tetrapyrrol-Biosynthese die Umsetzung von Coproporphyrinogen III zu Protoporphyrinogen IX. Diese Reaktion entspricht einer oxidativen Decarboxylierung zweier Propionatreste zu Vinylgruppen. Drei unterschiedliche Enzyme katalysieren die Reaktion ohne und mit Nutzung von Sauerstoff. Der Enzymmechanismus aller drei Oxidasen ist unbekannt. Das sauerstoffabhaengige Enzym (HemF) aus Escherichia coli wurde rekombinant produziert und mit einer neu entwickelten Methode affinitaetschromatographisch gereinigt. Es konnte ein schneller fluorimetrischer Aktivitaetsnachweis etabliert werden und die katalysierte Reaktion mittels HPLC bewiesen werden. Das als Dimer aktive HemF zeigte einen Km-Wert von 2.6 uM und einen kcat von 0.17 min-1 bei einem pH-Optimum von 6.0. Chelatisierungsreagenzien verringerten signifikant die enzymatische Aktivitaet von HemF. Als einziges Metall rekonstituierte Mangan die Enzymaktivitaet. Mangan konnte schliesslich im Enzym mittels UV/VIS-Spektroskopie, magnetischem Zirkulardichroismus (MCD) und Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) nachgewiesen werden. Mutagenese-Studien identifizierten H96, H106, H145, H175 und W274 als bedeutsam fuer die Katalyse. Als Produkt der enzymatischen Reaktion konnte Peroxid identifiziert werden. Ueberaschend konnte eine anaerobe Enzymaktivitaet von HemF gezeigt werden. Es wurden Hinweise fuer eine radikalische Reaktion bei der Umsetzung des Coproporphyrinogen III gefunden. Bei ersten Kristallisationsexperimenten wurden kleine Proteinkristalle erhalten. Aus diesen Ergebnissen konnte ein hypothetischer Reaktionsmechanismus entwickelt werden.

Tetrapyrrols are essential for life and therefore present in most biological systems. The seventh enzyme of the tetrapyrrole biosynthesis is the coproporphyrinogen III oxidase, representing three different types of enzymes. The catalyzed reaction is an oxidative decarboxylation transforming coproporphyrinogen III to protoporphyrinogen IX. The recombinant E. coli oxygen-dependent coproporphyrinogen III oxidase was purified to apparent homogeneity using a modified affinity chromatography system. Kinetically data were determined via an fluorimetric assay and HPLC. The dimeric enzyme showed a Km value of 2.6 uM with a kcat value of 0.17 min-1 at an optimal pH of 6. Addition of chelating reagents drastically reduced the enzymatic activity of HemF. Only manganese addition reconstituted HemF activity. Manganese was further identified as native metal in HemF using UV/VIS spectroscopy, magnetic circular dichroism (MCD) and atomic absorption spectroscopy (AAS). Site-directed mutagenesis identified H96, H106, H145, H175 and W274 as important amino acid residues for catalysis. Peroxide was identified as product of the enzymatic reaction. Surprisingly an anaerobic activity of HemF was detected. Indications for a radical enzymatic process were observed. Finally protein crystals of HemF were obtained. A mechanism for the enzymatic reaction of HemF was postulated based on the obtained data. The radical mechanism includes a redox active manganeseoxygen-complex inside the protein. The manganese-ion is probably bound by the highly conserved histidin residues.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Mahlitz, Esther: Die sauerstoffabhängige Coproporphyrinogen III Oxidase (HemF) aus Escherichia coli : Rekombinante Herstellung, biochemische und biophysikalische Charakterisierung. 2002.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export