Funktioneller Vergleich von S/MARs ('scaffold/matrix attachment regions') und Insulatoren im chromosomalen Kontext

Baer, Alexandra

Im eukaryontischen Zellkern ist die DNA durch die Assoziation mit Histonen als Chromatin organisiert. Ein gängiges Modell der Organisation des Interphasechromatins ist die Ausbildung einer Schlaufenstruktur in unabhängig regulierte Gendomänen. Diese werden durch S/MAR-Elemente (‘scaffold/matrix attachment regions’) begrenzt, welche durch ihre Bindung an die Kernmatrix die Basis der Chromatinschlaufen bilden. S/MAR-Elemente besitzen jedoch nicht nur strukturgebende Funktion, sondern sind auch entscheidend an der Genregulation beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss dieser Elemente auf die Expressionseigenschaften von Transgenen in den Zelllinien CHO K1 und NIH3T3 mit verschiedenen Untersuchungssystemen analysiert. Eine Analyse in Klongemischen zeigte eine deutliche transkriptionsaktivierende Wirkung dieser Elemente. Da der genomische Integrationsort einen nicht vorhersagbaren Einfluss auf die Transgenexpression hat, wurde im folgenden untersucht, ob die S/MAR-Wirkung dominant ist oder ebenfalls vom Integrationsort abhängt. Hierzu wurde ein auf sequenzspezifischer Exzision beruhender Ansatz genutzt. Dieser zeigte eine vom Integrationsort abhängige aktivierende oder reprimierende sowie von Chromatineinflüssen abschirmende Wirkung dieser Elemente. Daher wurde im dritten Teil der Arbeit die S/MAR-Wirkung mit der von Chromatin-Insulatoren verglichen, welche ebenfalls eine positionsunabhängige Genexpression ermöglichen. Zu diesem Zweck wurde ein auf Rekombinase- vermitteltem Kassettenaustausch basierendes Konzept entwickelt, welches den Vergleich der S/MAR- und Insulator-Wirkung sowohl in zufälligen Integrationsorten als auch vor dem gleichen genomischen Hintergrund erlaubt. In zufälligen Integrationsorten wurde ein aktivierender und von der genomischen Umgebung abschirmender Einfluss dieser Elemente bestätigt. Jedoch wurde deutlich, dass ihre Wirkung stark kontextabhängig ist.

In the eukaryotic nucleus the DNA is associated with histones and like this organized as chromatin. A current model of the organization of interphase chromatin is the formation of a loop structure of independently regulated gene domains. These are bordered by S/MAR elements (‘scaffold/matrix attachment regions’) which build up the basis of chromatin loops by binding to the nuclear matrix. S/MAR elements not only possess structural function but are also crucially involved in gene regulation. In this work the influence of these elements on expression properties of transgenes was analysed in the cell lines CHO K1 and NIH 3T3 using different examination systems. An analysis of clone mixtures showed a significant transcription activating influence of these elements. As the genomic integration site exerts a non-predictable influence on transgene expression, in the following it was examined if the S/MAR effect is dominant or depends also on the site of integration. To this end an approach based on site-specific excision was used. It was shown that S/MAR elements exert an activating or repressing effect depending on the site of integration and protect against influences of neighbouring chromatin. Therefore in the third part of the work the S/MAR effect was compared to the effect of chromatin insulators which also confer position-independent gene expression. For this a concept making use of recombinase-mediated cassette exchange was developed, which allows the comparison of S/MAR and insulator effects in random integration loci and also in the same genomic surrounding. In random integration loci it was confirmed that these elements have an activating influence and protect against position-effects. But it became clear that the effects are strongly context-dependent. As cassette-exchange was inefficient due to a high spontaneous resistance rate of the cell line, strategies for improving efficiency were developed.

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Baer, Alexandra: Funktioneller Vergleich von S/MARs ('scaffold/matrix attachment regions') und Insulatoren im chromosomalen Kontext. 2002.

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