Untersuchungen zur Osteogenese von humanen mesenchymalen Stammzellen

Bertram, Helge

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) stellen eine attraktive Quelle zur Konstruktion von biotechnologischem Knochenersatz dar. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob die osteogene Differenzierung von hMSCs durch Wachstumsfaktoren oder adenoviralen Gentransfer beschleunigt und stabilisiert werden kann. Durchflusszytometrisch wurden hMSCs als CD13 positive und hämatopoietisch negative, adhärend schnell proliferierende und osteogen differenzierbare Zellpopulation charakterisiert. Supplementierung mit rhFGF2 und rhFGF9 erhöhte die Proliferationsrate, rhBMP2 beschleunigte die chondro- / osteoblastizitäre Differenzierung, welches durch Untersuchung der Expression von Kollagen-Typ-I, Alkalischer Phosphatase und der Mineralisierung, sowie durch Transkriptanalyse belegt wurde. Bizistronische Adenoviren für BMP2, PDGFB, VEGF165 und sFLT1 mit GFP als Markergen wurden konstruiert und eine 80ige Gentransfereffizienz in hMSCs festgestellt. Expression und biologische Aktivität des Transgens wurden durch Western Blot, ELISA und zelluläre Tests untersucht. BMP2 rekombinante hMSCs zeigten beschleunigte osteoblastizitäre Differenzierung in vitro, adenovirales PDGFB verzögerte diese, wohingegen VEGF165 und sFLT1 diese nicht inhibierten. In vivo zeigten hMSCs auf Kollagenträgern ektopische Knochenbildung, wohingegen dies auf PLLA-Trägern nicht nachweisbar war. GFP Expression von hMSCs konnte 8 Wochen nach Implantation detektiert werden. AdBMP2 transduzierte hMSCs zeigten auf PLLA-Trägern, im Gegensatz zu Kontrollen, ausgeprägte heterotope Mineralisierung. Dies belegt die prinzipielle Eignung des Einsatzes von hMSCs in der zellbasierenden Gentherapie von Knochendefekten.

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are an attractive source for construction of bioengineered bone replacement materials. Aim of this study was to evaluate exogenous growth factors and adenoviral gene transfer as a tool to accelerate and stabilize osteogenic differentiation of hMSCs. Flow cytometry characterised hMSCs as CD13+ and haematopoietic negative, fast proliferating cell population capable of osteogenic differentiation. rhFGF2 and rhFGF9 increased proliferation, rhBMP2 accelerated osteo-/chondrogenic differentiation as was shown by expression of collagen-I, alkaline phosphatase, mineral deposition and study of specific transcripts. Adenoviral constructs using BMP2, PDGFB, VEGF165, sFLT1 and GFP as markergene in a bicistronic expression cassette were constructed and hMSCs successfully transduced. Expression of transgene and biological activity was shown by Western Blot, ELISA and cellular assays. BMP2 recombinant hMSCs showed accelerated osteoblastic differentiation in vitro, adenoviral PDGFB delayed and VEGF165 and sFLT1 did not inhibit differentiation. In vivo, hMSCs showed ectopic bone formation on collagen sponges but not on PLLA scaffolds. GFP expression was still detectable 8 weeks after implantation. AdBMP2 recombinant hMSCs seeded on PLLA scaffolds demonstrated bone cell differentiation and production of mineralized tissue, which was confirmed by microradiography and histological staining. The maintenance of the osteoblast phenotype in vitro and generation of mineralised 3-D scaffolds containing recombinant hMSCs in vivo indicates the potential of cell mediated gene therapy in bone tissue engineering approaches.

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Bertram, Helge: Untersuchungen zur Osteogenese von humanen mesenchymalen Stammzellen. 2002.

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