Posttranslationale Modifikation von Aldehydoxidasen und Xanthindehydrogenase : Isolierung und Charakterisierung der Molybdän-Cofaktor-Sulfurase ABA3 aus Arabidopsis thaliana

Bittner, Florian

Das katalytisch wirksame Metall Molybdän (Mo) ist Bestandteil aller Molybdoenzyme, die diverse Redox-Reaktionen im C-, N- und S-Metabolismus aller Organismen ausführen. Mo ist dabei über den Molybdäncofaktor (Moco) komplexiert und bindet Liganden, die die Mo-Enzyme in zwei Klassen teilen: Dioxo-Mo-Enzyme wie Nitratreduktase und Sulfitoxidase mit zwei O-Atomen am Mo und Monooxo-Mo-Enzyme wie Aldehydoxidasen (AO) und Xanthindehydrogenase (XDH) mit nur einem O-Atom und einem S-Atom, das durch eine Moco-Sulfurase angefügt wird. In diesem Schritt defekte pflanzliche Mutanten wie aba3 aus Arabidopsis thaliana verlieren jede AO- und XDH-Aktivität, die jedoch in Rohextrakten durch anaerobe Behandlung mit Sulfid und Dithionit wiederhergestellt werden können. Ferner führt die starke Reduktion des essentiellen Phytohormons Abscisinsäure (ABA), dessen Synthese im letzten Schritt durch eine AO katalysiert wird, zur Aufhebung der Samenruhe, einem welkigen Habitus und einer reduzierten Streßantwort. In der vorliegenden Arbeit wurde mit ABA3 aus Arabidopsis thaliana die erste pflanzliche Moco-Sulfurase kloniert und molekular wie biochemisch beschrieben. ABA3 besitzt eine N-terminale NifS-ähnliche Domäne und eine C-terminale Domäne, die die Erkennung von AO und XDH vermitteln könnte. Wie NifS-Proteine zeigt das gereinigte ABA3 aufgrund der Bindung von PLP eine gelbe Färbung, eine L-Cysteindesulfurase-Aktivität und der als Persulfid gebundene Schwefel kann von ABA3 auf eine rekombinante AO übertragen werden. Da die Expression von aba3 durch Trockenstreß und ABA induzierbar ist, kann auf eine positive 'feed-back' Regulation der ABA-Synthese durch ABA3 geschlossen werden.

Molybdenum (Mo) containing enzymes catalyze diverse redox reactions within the C-, N- and S-metabolism in all organisms. In these enzymes Mo is complexed in the molybdenum cofactor (Moco) and binds ligands that devide Mo-enzymes into two classes: dioxo-Mo-enzymes like nitrate reductase and sulfite oxidase with two O-atoms at the Mo-center and monooxo-Mo-enzymes like aldehyde oxidase (AO) and xanthine dehydrogenase (XDH) with only one O-atom and a S-atom that has to be added by a Moco-sulfurase. Plant mutants deficient in this step, like aba3 from Arabidopsis thaliana, do not show AO- and XDH-activity, but crude extracts of them can be restored by anaerobic treatment with sulfide and dithionite. The strong reduction of the essential phytohormone abscisic acid (ABA), which in the last step of synthesis is produced by an AO, leads to further features like the loss of seed dormancy, a wilty phenotype and reduced stress response. This work describes the cloning of ABA3 from Arabidopsis thaliana, the first plant Moco-sulfurase isolated so far, as well as its molecular and biochemical characterization. The ABA3 protein consists of an N-terminal NifS-like domain and a C-terminal domain that might be involved in the recognition of AO and XDH. Due to its similarities to NifS proteins purified recombinant ABA3 is yellow in color and is able to desulfurate L-cysteine and it transfers the bound persulfide to a recombinant AO in vitro. The binding sites for PLP and the persulfide that it released from L-cysteine are shown by site directed mutagenesis. For complementation of aba3 mutants the entire aba3 gene was used and aba3 transcription is shown to be inducible by drought stress and ABA, indicating a positive feed-back regulation of ABA synthesis by ABA3.

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Bittner, Florian: Posttranslationale Modifikation von Aldehydoxidasen und Xanthindehydrogenase : Isolierung und Charakterisierung der Molybdän-Cofaktor-Sulfurase ABA3 aus Arabidopsis thaliana. 2002.

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