Der zweite Schritt der Molybdäncofaktor Biosynthese : Molekularer Mechanismuns der Konversion von PrecursorZ zu Molybdopterin

Gutzke, Gerrit

Die Biosynthese des Molybdäncofaktors in Eukaryonten kann in drei Schritte unterteilt werden. Ausgehend von einem Guanosinderivat wird die schwefelfreie Pterinverbindung PrecursorZ hergestellt. Die Einführung einer Dithiolengruppe durch die MPT-Synthase schliesst die Synthese der organischen Komponente des Cofaktors ab. Molybdopterin (MPT) wird im letzten Schritt durch die Komplexierung von Molybdat in aktiven Moco umgewandelt. Die Aufklärung des molekularen Reaktionsmechanismus der Konversion von PrecursorZ zu MPT stand im Mittelpunkt dieser Arbeit. Gelfiltrationsexperimente deuteten darauf hin, dass die E.coli MPT-Synthase ein heterotetrameres Enzym ist, das aus je zwei kleinen und grossen Untereinheiten besteht.Das Intein-Protein-Expressionssystem lieferte den Schlüssel zur funktionellen Charakterisierung der MPT-Synthase. Die postulierte in vivo Aktivierung durch Schwefelübertragung auf den C-Terminus der kleinen Untereinheit wurde in vitro ermöglicht. Damit konnte die kleine Untereinheit sowohl in nicht-modifizierter als auch in potentiell aktivierter Form als C-terminales Thiocarboxylat hinsichtlich ihrer Komplexbildungseigenschaften mit der grossen Untereinheit und resultierender Aktivität untersucht werden. Die in vitro Assemblierung des MPT-Synthase Komplexes aus seinen einzeln exprimierten Untereinheiten erfolgte unabhängig vom Zustand der kleinen Untereinheit. Anschliessende Aktivitätsmessungen belegten jedoch eindeutig, dass für eine Aktivierung der kleinen Untereinheit die C-terminale Thiocarboxylierung unabdingbar ist. Aktive pflanzliche und humane MPT-Synthase konnte zwar ebenfalls mit Hilfe des InteinSystems erzeugt werden, die Aktivitäten lagen jedoch im Vergleich zur bakteriellen nur etwa bei 5 bzw. 1,4 Im humanen System liess sich die geringe Aktivität auf die inaktive grosse Untereinheit zurückführen, während im pflanzlichen System die inaktive kleine Untereinheit verantwortlich war.

The molybdenum cofactor is synthesized by an evolutionary old pathway. In Escherichia coli, MPT is formed by incorporation of two sulfur atoms into precursor Z which is catalyzed by the MPT synthase. The recently solved crystal structure of MPT synthase shows the heterotetrameric nature of the enzyme that is composed of two small (MoaD) and two large subunits (MoaE). According to sequence and structural similarities between MoaD and ubiquitin a thiocarboxylation of the C-termins of MoaD is proposed which would serve as the source of sulfur that is transferred through the reaction. Here, we describe the in vitro generation of thiocarboxylated MoaD and the assembly of inactive carboxylated and fully active thiocarboxylated MPT synthase. Both separately expressed and purified subunits are monomeric and they form a heterotetrameric complex after coincubation in equimolar ratios either with carboxylated or thiocarboxylated MoaD. However, slight but significant differences between the active and inactive MPT synthase can be seen using size exclusion chromatography. Since only thiocarboxylated MPT synthase is able to convert precursor Z in vitro to MPT we propose a two-step reaction of MPT synthesis where the dithiolene is generated by two thiocarboxylates from a single tetrameric MPT synthase. A two-step reaction with the formation of a hypothetical intermediate carrying one sulfur atom is proposed. First, the carboxyl group of the C2 atom in the side chain of precursor Z is protonated followed by a nucleophilic attack of the sulfur from the first thiocarboxylate of MPT synthase. After carboxylation of the small subunit precursor G is released. The conformational change of the first dimer would result in an induced fit of the second heterodimer generating an active site with an increased affinity for the intermediate and a decreased affinity for precursor Z.

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Gutzke, Gerrit: Der zweite Schritt der Molybdäncofaktor Biosynthese : Molekularer Mechanismuns der Konversion von PrecursorZ zu Molybdopterin. 2002.

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