Struktur- und Funktionsuntersuchungen an der Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC) aus Listeria monocytogenes und der Ena/VASP-Homologie 1 (EVH1)-Domäne des murinen Vesl-2

Barzik, Melanie

1. Studien zur Substratbindung der PI-PLC aus L. monocytogenes Um Informationen über die Bindung des Diacylglycerinphosphatanteils von PI durch die PI-PLC aus L. monocytogenes zu erhalten, wurden PI-PLC-Mutanten heterolog in E. coli produziert, gereinigt und zur Kokristallisation mit verschiedenen Substratanaloga eingesetzt. Zusätzlich wurde die Aktivität der Mutanten mit zwei unterschiedlichen Substraten untersucht. Der Austausch einzelner Aminosäuren im aktiven Zentrum der PI-PLC führte zur starken Reduktion der katalytischen Aktivität, wobei die Faltungstopologie der PI-PLC-Mutanten mit der des Wildtyp-Enzyms nahezu identisch war. Mittels Röntgenstrukturanalyse konnten die Substratanaloga jedoch in keiner der aufgeklärten PI-PLC-Strukturen zweifelsfrei nachgewiesen werden. 2. Die EVH1-Domäne von mVesl Die EVH1-Domäne des murinen Vesl-2 (mVesl), einem Mitglied der Homer/Vesl-Proteinfamilie, wurde heterolog in E. coli produziert, gereinigt und zur Kokristallisation mit synthetischen prolinreichen Peptiden eingesetzt, die von den natürlichen Interaktionspartnern abgeleitet worden waren. Die Struktur der mVesl EVH1-Domäne wurde sowohl in freier Form als auch in Komplex mit Teilen eines IP3R-Peptids bei einer Auflösung von 2.2 Å gelöst. Basierend auf diesen strukturellen Daten wurde eine Klassifizierung der bekannten EVH1-Domänen in zwei Gruppen vorgenommen. Die EVH1-Domänen der Ena/VASP-Proteinfamilie wurden der Klasse I zugeordnet, während die Homer/Vesl EVH1-Domänen die Klasse II bilden. Zusätzlich wurde mittels Oberflächen-Plasmonenresonanzspektroskopie gezeigt, dass die verwendeten prolinreichen Peptide mit mäßiger Affinität (KD: 1.5 - 2.9 mM) von mVesl EVH1 gebunden werden.

1. Substrate binding studies of PI-PLC from L. monocytogenes Enzymatic activity and cocrystallization experiments of site-directed mutants using diverse substrate analogs were used to analyze the binding of the diacylglycerolphosphate moiety of PI to PI-PLC. Single-amino acid substitutions within the active site significantly decreased catalytic activity, despite marginal structural differences between mutants and wild-type enzyme. Of the crystal structures of PI-PLC determined in this work, none, however, contained a clearly defined substrate analogue in the active site. 2. The EVH1 domain of mVesl The EVH1 domain of murine Vesl-2, a member of the recently discovered Homer/Vesl protein family was cloned, purified and crystallized. The structure was subsequently solved and refined at 2.2 Å resolution. The Homer/Vesl EVH1 domain was identified as a new class II EVH1 domain. Furthermore, ligand binding by the Vesl-2 EVH1 domain was investigated using surface plasmon resonance spectroscopy.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Barzik, Melanie: Struktur- und Funktionsuntersuchungen an der Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC) aus Listeria monocytogenes und der Ena/VASP-Homologie 1 (EVH1)-Domäne des murinen Vesl-2. 2002.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export