Genetic and biochemical characterization of two new extradiol dioxygenases of Sphingomonas sp. strain RW1 and construction of two gene cassettes for biodegradation of dibenzofuran and dioxin

D'Enza, Marina

Das Ziel dieser Arbeit war es, zwei Genkassetten zu konstruieren, welche die Gene für den oberen Abbauweg von Dibenzo-p-dioxin und Dibenzofuran aus Sphingomonas sp. RW1 enthalten. Mit Hilfe dieser Kassetten sollen Bakterien befähigt werden, chlorierte Dioxine und Dibenzofuran vollständig zu mineralisieren. Hierfür wurde zunächst die Umsetzung von Dioxin und Dibenzofuran in RW1 biochemisch und genetisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß mindestens drei unterschiedliche Extradioldioxygenasen (DbfB, Edo2 und Edo3) in RW1 existieren. Alle drei Enzyme zeigen eine rasche Inaktivierung bei der Umsetzung des Substrates 2,2´,3-Trihydroxybiphenylether (THBE) zu den Produkten Catechol und 2-Pyrone-6-caboxylat. Diese Inaktivierung war abhängig sowohl von der Anwesenheit von Sauerstoff als auch von der Substratumsatzrate und war bei Edo3 und Edo2 weniger stark ausgeprägt als bei DbfB. Auf Grundlage der kinetischen Daten wurden die Gene der geeigneten Extradioldioxygenasen zur Konstruktion der Genkassetten ausgewählt. Die Funktionsfähigkeit der Dibenzofuran-Genkassette mit dbfB konnte durch die quantitative Umsetzung von Dibenzofuran zu Salicylat nachgewiesen werden. Aufgrund der Inaktivierung der Extradioldioxygenasen führten beide Genkassetten zum Abbau des Dibenzo-p-dioxin nur bis zum THBE. Erst durch die Erhöhung der Edo2 Konzentration im Transformationstest konnte die Eignung von Edo2 für die weitere Umsetzung des THBE nachgewiesen werden.

The major goal of this study was the development of two gene cassettes carrying all genes for dibenzo-p-dioxin and dibenzofuran degradation upper pathway from Sphingomonas sp. strain RW1. Such cassettes should be used to create organisms capable to entirely mineralise chlorodioxins and chorodibenzofurans. To this end, the dioxin and dibenzofuran catabolism in RW1 strain was initially investigated on a genetic and biochemical level. It could be shown that at least three different extradiol dioxygenases are encoded in the RW1 genome, namely DbfB, Edo2 and Edo3. All of them were rapidly inactivated during transformation of the substrate 2,2´,3-trihydroxybiphenyl ether (THBE) into catechol and 2-pyrone-6-carboxylate, identified as reaction products. The inactivation was dependent on the presence of oxygen and substrate turnover and was very effective for all enzymes, but less pronounced for Edo3, and especially Edo2. Based on the kinetic studies, the appropriate extradiol dioxygenases coding genes to be included in the gene cassettes have been selected. The dibenzofuran gene cassette, comprising dbfB, was performing properly as evidenced by quantitative transformation of dibenzofuran into salicylate. Both gene cassettes transformed dibenzo-p-dioxin into THBE only, due to inactivation of the extradiol dioxygenases. By increasing the concentration of Edo2 in the transformation test it could be verified that Edo2 is suited, however imperfectly, for the further transformation of THBE.

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D'Enza, Marina: Genetic and biochemical characterization of two new extradiol dioxygenases of Sphingomonas sp. strain RW1 and construction of two gene cassettes for biodegradation of dibenzofuran and dioxin. 2001.

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