Optimierung der Kultur und Charakterisierung primärer embryonaler Hepatozyten der Ratte

Schmelzer, Eva

In dieser Arbeit wurde in vitro die Proliferation und Differenzierung embryonaler Hepatozyten untersucht. Im Rattenmodell wurden daher die Kulturbedingungen der Hepatozyten variiert und optimiert. Mit Hilfe von Analysen sowohl auf genomischer als auch funktioneller Ebene wurde eine umfassende Charakterisierung der Hepatozyten in Kultur durchgeführt. Untersucht wurde der Einfluß verschiedener Matrizes (Collagen I, IV, Matrigel, Laminin), feeder-Zellen (3T3, MRC-5, primäre Fibroblasten) und Wachstumsfaktoren einzeln oder in Kombination (Thrombopoietin [TPO], Hepatocyte-, Epidermal- und Transforming Growth Factor) auf die Proliferation und Differenzierung der embryonalen Hepatozyten. Die Proliferation und Differenzierung embryonaler Hepatozyten in Kultur werden eindeutig von der Art der verwendeten Beschichtung bzw. feeder-Zellen beeinflußt. Maximale, über 30fache Zellvermehrung, wurde nach 12 Tagen in Kultur auf 3T3 feeder-Zellen mit Zusatz von TPO erreicht. Es konnte erstmalig ein proliferativer Effekt von TPO auf Hepatozyten in Kultur gezeigt werden. Die auf 3T3 feeder-Zellen mit TPO kultivierten Zellen wiesen ein RNA Expressionsprofil ähnlich dem adulter Hepatozyten auf. Zusätzlich wurden Differenzierungsmarker nachgewiesen: Es konnte Albuminsekretion über einen Untersuchungszeitraum von 30 Tagen gemessen werden; durch Immuncytochemie wurden Albumin, GST und verschiedene Cytochrome detektiert; es konnte Cytochrom-P450 Aktivität nachgewiesen werden.

The aim of the present dissertation was to investigate in vitro proliferation and differentiation of embryonic rat hepatocytes. Therefore, culture conditions of hepatocytes were varied and optimised. A widespread characterisation of embryonic hepatocytes in culture was realised by using genomic as well as functional methods of analysis. The influence of various matrices (collagen I, IV, matrigel, laminin), feeder cells (3T3, MRC-5, primary fibroblasts) and growth factors (thrombopoietin [TPO], hepatocyte growth factor, epidermal growth factor and transforming growth factor alpha) alone or in combination on proliferation and differentiation of these embryonic hepatocytes was studied. Proliferation and differentiation of embryonic hepatocytes in culture is clearly affected by type of coating and feeder cell, respectively. After 12 days in culture maximal increase in cell number (more than 30 fold) was observed using 3T3 as feeder cells in combination with TPO. For the first time a proliferative effect of TPO on hepatocytes could be demonstrated. The RNA profile of expression of hepatocytes cultured on 3T3 feeder cells supplemented with TPO bear resemblance to that of adult hepatocytes. In addition, markers of differentiation could be verified. Secretion of albumin could be measured during an observation period of 30 days. Immuncytochemistry revealed expression of albumin, GST, and various cytochromes. Cytochrome P450 activities could be detected for several days in culture.

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Schmelzer, Eva: Optimierung der Kultur und Charakterisierung primärer embryonaler Hepatozyten der Ratte. 2002.

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