Conditional Inactivation of N-WASP in the mouse. Analyses of N-WASP function.

Lommel, Silvia

N-WASP aktiviert den Aktinfilament-Nukleator Arp2/3 Komplex in Abhängigkeit von Signaltransduktionsvorgängen und spielt damit eine Schlüsselrolle in der Regulation des Aktinzellskeletts. Um die Funktion von N-WASP zu untersuchen, wurden durch gezielte Mutagenese mittels homologer Rekombination in embryonalen Stammzellen Mäuse hergestellt, die ein loxP flankiertes N-WASP Allel tragen und die damit eine gewebsspezifische und zeitlich kontrollierte Inaktivierung des N-WASP Gens in Abhängigkeit der Cre Rekombinase erlauben. Um die Rolle von N-WASP während der Embryonalentwicklung zu erforschen, wurde das N-WASP Gen in der Keimbahn der Maus inaktiviert, was zum Absterben der betroffenen Embryonen führte. Um die Funktion von N-WASP auf zellulärer Ebene zu analysieren, wurden mehrere N-WASP-defekte embryonale Fibroblastenzelllinien etabliert. Diese N-WASP-defekten Zellen zeigten keine auffälligen morphologischen Veränderungen, vor allem war die durch konstitutiv aktives Cdc42 induzierte Ausbildung von Filopodien nicht beeinträchtigt. Eine Analyse der durch pathogene Bakterien induzierten Reorganisationsvorgänge des Aktinzellskeletts zeigten, dass ohne N-WASP die intrazelluläre Fortbewegung von Shigella flexneri unterbunden war. Rekonstitutionen mit verschiedenen GFP-N-WASP Mutanten zeigten, dass N-WASP unabhängig von der CRIB Domäne an Shigellen rekrutiert wird und Rho GTPasen nicht zur Rekrutierung und Motilität beitragen. Weiterhin konnten enteropathogene und enterohämorrhagische Escherichia coli in N-WASP-defekten Zellen keine Aktinpodeste mehr induzieren. Es konnte gezeigt werden, dass N-WASP über eine im Aminoterminus liegende Rekrutierungsdomäne rekrutiert wird. Diese Resultate zeigen die essentielle Rolle des N-WASP Proteins in den von diesen Pathogenen induzierten Reorganisationsvorgängen des Aktinzellskeletts in vivo und beweist zudem zum ersten mal, dass, zumindest in diesen Fibroblasten, N-WASP für eine Ausbildung von Filopodien nicht notwendig ist.

N-WASP is a potent activator of the Arp2/3 complex in vitro and harbours key regulatory functions for cellular actin assembly in response to signalling. To analyse N-WASP function, mice carrying a loxP flanked N-WASP allele were generated using gene targeting in embryonic stem cells and the Cre/loxP recombination system. N-WASPflox/flox mice allow the conditional inactivation of the N-WASP gene by Cre recombinase mediated deletion in a tissue specific and temporally controlled manner. The N-WASP gene was disrupted in the mouse germline, which led to embryonic lethality. To elucidate the role of N-WASP at the cellular level, embryonic fibroblasts from N-WASPflox/flox mice were immortalized and various N-WASP-defective cell lines were selected upon transient expression of Cre recombinase. These N-WASP-defective fibroblasts showed no apparent morphological alterations and were highly responsive to the induction of filopodia by microinjection of constitutively active Cdc42, but failed to support the intracellular motility of Shigella flexneri. Reconstitution experiments using GFP-tagged N-WASP and various GFP-N-WASP mutants revealed a recruitment mechanism independent of the CRIB domain and Cdc42. In addition, enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli were incapable of inducing the formation of actin pedestals in N-WASP-defective cells. In reconstitution experiments, N-WASP recruitment and EPEC pedestal formation was shown to be independent of small Rho family GTPases and the CRIB domain, but to be mediated by a recruitment domain in the amino-terminal half of N-WASP. These results prove the essential role of N-WASP for actin cytoskeletal changes induced by these bacterial pathogens in vivo and in addition show for the first time that N-WASP is dispensable for filopodia formation.

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Lommel, Silvia: Conditional Inactivation of N-WASP in the mouse. Analyses of N-WASP function.. 2002.

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