Molekulare Charakterisierung und pathogene Bedeutung von cholinbindenden Proteinen von Streptococcus pneumoniae

Prieß, Petra

Aus einer chromosomalen Pneumokokkengenbank konnten cholinbindende Proteine bzw. deren Gene isoliert werden. Allerdings handelte es sich bei den Sequenzen um die bereits bekannten Gene spsA, pspA, pcpA und lytA. Mit einer Computer-unterstützten Genomanalyse konnten 6 weitere Cbp identifiziert werden. Das mit 627 Aminosäuren größte Protein (P4139) wurde kloniert. Immunfluoreszenzversuche ergaben die Oberflächenlokalisation dieses Proteins. Eine schwache Bindung von IgG und humanem Fibrinogen konnte nachgewiesen werden. Weiterhin gelang der Nachweis, daß S. pneumoniae humanes Lactoferrin (hLf) als einzige Eisenquelle zum Wachstum unter eisenlimitierenden Bedingungen verwenden kann. Als der bakterielle Ligand der hLf-Bindung wurde PspA identifiziert. PspA-Deletionsmutanten bestätigten PspA als Lf-bindendes Protein. Die Lf-Bindungsdomäne von PspA konnte auf das 15er Peptid 'YFKEGLEKTIAAKKA' eingegrenzt werden. Der Mechanismus der Eisenaufnahme erfolgt über die proteolytische Spaltung von hLf. Mit einem sogenannten 'Fest-Phasen-Protease-Versuch', bei dem radioaktiv-markiertes humanes Lf immobilisiert wurde, und Wachstumsversuchen mit 125I-hLf konnte die proteolytische Aktivität von PspA gegenüber Lf zum ersten Mal nachgewiesen werden. Die Proteolysedomäne ist zwischen Aminosäure 105 und 167 (NCTC 7978) lokalisiert. Mit der PspA-Deletionsmutanten und einer Proteolyse-Defekt-Mutanten konnte gezeigt werden, daß die Proteolyse gegenüber der Bindung des Lf der wachstumslimitierende Schritt ist. Obwohl die Deletionsmutante kein hLf mehr band, konnte ein Wachstum mit Lf beobachtet werden. Im Gegensatz dazu, konnte die Proteolyse-Defekt-Mutante zwar Lf binden, jedoch nicht mehr wachsen.

Via southern blot analysis it was possible to identify genes which encode cholin binding proteins (Cbp) from a gene library of Streptococcus pneumoniae (NCTC 7465). Sequence analysis revealed the known genes spsA, pspA, pcpA und lytA. With a computer-aided genome analysis 6 new Cbp could be identified. The largest protein (P4139) with 627 amino acids was cloned and immunfluorescence studies confirmed the surface localization of this protein. A weak binding of IgG and human fibrinogen was observed. It could be shown that S. pneumoniae was able to use human lactoferrin (hLf) as the only iron source in iron restricted media. The 'Pneumococcal surface protein A' (PspA) could be identified as the bacterial ligand for the binding of hLf. Deletion mutants confirmed PspA as the Lf-binding protein. The binding domain for hLf was mapped to the 15 amino acid peptide 'YFKEGLEKTIAAKKA'. The mechanism to obtain iron from hLf to support growth of S. pneumoniae was mediated by the proteolytic cleavage of hLf. A 'solid-phase-protease-assay' with immobilised radioactiv labelled hLf as well an assay with soluble radioactiv labelled hLf demonstrated that the proteolytic cleavage was mediated by PspA itself. The proteolytic domain was localized between amino acid 105 and 167 (NCTC 7978). With the aid of a PspA-deletion mutant and a proteolytic-defect mutant it could be shown that the binding of hLf and not the proteolytic cleavage was the growth limiting step in iron utilization from Lf. Though the PspA-deletion mutant was not able to bind hLf it could utilize hLf as an iron source to support growth. In contrast, the proteolytic-defect mutant was able to bind but not to utilize hLf.

Vorschau

Zitieren

Zitierform:

Prieß, Petra: Molekulare Charakterisierung und pathogene Bedeutung von cholinbindenden Proteinen von Streptococcus pneumoniae. 2002.

Zugriffsstatistik

Gesamt:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:
12 Monate:
Volltextzugriffe:
Metadatenansicht:

Details anzeigen

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export